肝癌樹突狀細胞瘤苗的制備及其誘導AFP特異性T淋巴細胞反應的實驗研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中絕大多數(shù)為肝細胞癌(Iaepa，tocelluIar carcinoma，HCC)。近半個世紀以來，隨著醫(yī)學物理學、影像學、麻醉學、免疫學、分子生物學的不斷發(fā)展及外科技術(shù)的日益成熟，我國原發(fā)性肝癌的治療取得了很大的進展，手術(shù)切除率、術(shù)后生存率及術(shù)后生活質(zhì)量均有較大提高，尤其是進入20世紀90年代以后，以外科手術(shù)切除治療為主包括放療、化療、

2、和免疫治療的綜合治療觀念已占主導地位，然而較高的術(shù)后復發(fā)率仍是影響肝癌預后的最主要因素，肝癌根治性切除術(shù)后的5年復發(fā)率仍超過60％，即使小肝癌切除后其復發(fā)率也高達40％以上。隨著分子生物學和免疫學的研究進展，腫瘤的生物治療展現(xiàn)出美好的應用前景而成為腫瘤學研究的熱點，并被稱為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種治療模式。 隨著抗原呈遞和免疫識別的研究進展，樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)在免疫反應中的核心作用逐漸為人

3、們所認識。腫瘤免疫治療是通過激活機體的免疫系統(tǒng)來清除腫瘤細胞，其關(guān)鍵是產(chǎn)生腫瘤特異的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CT、Ls)。研究表明：有效的抗腫瘤CTLs應答需要專職抗原呈遞細胞(antigen presenting cells，APC)——樹突狀細胞(DCs)來激活T淋巴細胞。DCs在激活抗原特異性T淋巴細胞及維持T淋巴細胞活性方面具有重要作用，它是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能激活未致敏T細胞(naive

4、 T cells)的APC，它能有效地刺激幼稚T細胞增殖，并建立初級免疫反應，同時產(chǎn)生免疫記憶。近年來，隨著DCs疫苗抗瘤作用研究的開展，DCs已成為當今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點之一。研究者運用各種形式的抗原修飾DCs(腫瘤細胞裂解物、溶解病毒或腫瘤蛋白、多肽、DNA或RNA等)，再將經(jīng)過修飾的DCs回輸入動物模型或人體內(nèi)，取得了較好的抗瘤效果。本實驗擬分離、培養(yǎng)健康人外周血單核細胞來源的DCs，應用多細胞因子雞尾酒法誘導其成熟并

5、負載經(jīng)熱休克處理后的肝癌細胞凍融抗原，探討其誘導、活化肝癌特異性T淋巴細胞的作用。 研究目的 1．探索肝癌樹突狀細胞瘤苗的制備方法。 2．探討肝癌樹突狀細胞瘤苗誘導AFP特異性T淋巴細胞應答的作用。 材料與方法 1．DCs的分離、培養(yǎng)及肝癌樹突狀細胞瘤苗的制備抽取10例健康自愿者外周血，分離單個核細胞(peripheral blood mononu． clear cells，PBMCs)，用含10

6、％胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸浮并接種于25cm培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱中貼壁2h后，洗去非貼壁淋巴細胞培養(yǎng)備用，將貼壁單個核細胞以GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(500U/ml)誘導為未成熟DCs，第6天分組誘導成熟，A：對照組，僅用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)；B：凍融抗原負載誘導組，加入AFP陽性肝癌細胞株Bel-7402的熱休克凍融抗原；C：雞尾酒法誘導組，加入細胞因子組合(1000U/mlTNF-α、10

7、ng/mlIL-6、10ng/mlIL-1β、1μg/ml PGE2)誘導成熟；D：肝癌細胞熱休克凍融抗原負載+雞尾酒法誘導組。各組均在誘導24小時后收獲DCs，流式細胞儀進行細胞表型分析，熒光標記觀察CDS0、CD83、CD86、HLA-DR的表達。 2．成熟DCs體外誘導T淋巴細胞活化的ELISPOT檢測我們采用ELISPOT技術(shù)檢測成熟DCs刺激T淋巴細胞活化的活性，按照試劑盒的說明操作，將T細胞分別與不同的刺激物種植于E

8、LISPOT專用的捕捉抗體包被的96孔板內(nèi)，分組如下，A：陰性對照組，僅加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基；B：加入雞尾酒法誘導成熟的DCs；C：加入肝癌細胞熱休克凍融抗原負載+雞尾酒法誘導成熟的DCs；D：陽性對照組，加入10ul植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)。各組均置于37℃、5％CO2共孵育24-48小時。顯色后所得斑點即代表分泌細胞因子的細胞數(shù)，用酶聯(lián)免疫斑點圖像自動分析儀(Bioreader 4000

9、，德國BIOSYS公司)分析。 3．抗原負載的DCs體外誘導特異性抗肝癌CTLs的檢測取HLA-A2陽性自愿者自體非貼壁細胞淋巴細胞作為效應細胞，按1：10比例加入誘導成熟的DCs，實驗分組如下，A組：加入經(jīng)雞尾酒法誘導成熟的DCs；B組：加入經(jīng)雞尾酒+肝細胞癌熱休克凍融抗原誘導成熟的。DCs。兩組均于共培養(yǎng)5天后收獲細胞，應用DimerX技術(shù)檢測各組中特異性抗肝癌CTLs的百分率。 4．成熟DCs體外誘導T淋巴細胞增殖的檢測取

10、經(jīng)熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(5,6-carboxynuorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)標記后的人同種異體淋巴細胞作為效應細胞，成熟DCs作為刺激細胞，分組培養(yǎng)，A組：對照組，加入等體積完全培養(yǎng)基；B組：實驗組，按1：10比例加入經(jīng)雞尾酒法誘導成熟的DCs；C組：按1：10比例加入經(jīng)肝細胞癌熱休克凍融抗原負載+雞尾酒法誘導成熟的：DCs。各組均于共培養(yǎng)3天后收獲，應用流式

11、細胞儀技術(shù)檢測淋巴細胞的增殖情況。 實驗結(jié)果 1.DCs成熟表型的熒光染色觀察熒光顯微鏡觀察可見CD80、CD83、CD86、HLA-DR均分布于細胞膜上，熒光雙染可見細胞膜呈橙色熒光。 2．DCs成熟表型的檢測B組、C組、D組的成熟表型CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表達與A組相比均有明顯提高(P<0.05)，其中，C組和D組又較B組顯著提高(P<0.05)，但C組與D組相比無顯著性差異(P>0.0

12、5)。 3．成熟：DCs誘導T淋巴細胞活化的ELISPOT檢測平均每1×10<'5>個淋巴細胞可檢測到的分泌IFN-γ的斑點數(shù)分別為A組10、B組102、C組106、D組365，結(jié)果說明成熟DCs能夠有效地激活T淋巴細胞并使其分泌INF-γ。 4．抗原負載的DCs體外誘導特異性抗肝癌CTLs的檢測未負載熱休克凍融抗原組誘導的CD8+的CTL平均結(jié)合表位肽A、B DimerX復合物的陽性細胞數(shù)分別為0.042％和0.045

13、％；負責熱休克凍融抗原組誘導的CD8+的CTL結(jié)合表位肽A、B DimerX復合物的陽性細胞數(shù)分別為1.06％和1.12％，明顯高于未負載熱休克凍融抗原組(P<0.05)。 5．成熟DCs體外誘導T淋巴細胞增殖的檢測B組和C組分別有26.35％和28.52％的細胞發(fā)生分裂，其中分別有8.46％和10.18％分裂3-5次，與A組的11.23％和1.46％相比有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果表明，成熟DCs體外能夠有效地誘導T淋巴

14、細胞分裂增殖。 結(jié)論 1．聯(lián)合多細胞因子的雞尾酒法可以高效誘導人單核細胞來源的DCs成熟。雞尾酒法由多種常用的細胞因子組成，如果聯(lián)合使用治療級無血清培養(yǎng)體系，可以滿足臨床制備DCs瘤苗對安全性、有效性和質(zhì)量控制的要求。 2．負載肝細胞癌熱休克凍融抗原的DCs瘤苗體外能夠有效地激活T淋巴細胞，促進其分裂增殖，并增強其分泌IFN-γ的能力。 3．本研究制備的肝癌DCs瘤苗體外可誘導出針對多個AFP HLA-A