利用核酶自剪切機(jī)制建立HCV穩(wěn)定分泌細(xì)胞模型和小鼠模型.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起人類丙型肝炎的病原體。全球HCV的感染率約為3％，近1.7億人感染HCV[1]。我國約為5000萬人，并且年發(fā)病人數(shù)呈高速上升趨勢，2009年發(fā)病人數(shù)比2003年上升了534％，達(dá)到131849人。HCV感染易慢性化[2]，其慢性化率可高達(dá)70％，部分慢性丙型肝炎患者最終可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。目前臨床上主要采用干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療丙型肝炎，但該療法并非

2、對所有慢性丙型肝炎患者均有效，約50％患者不能產(chǎn)生持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，其中Ⅰ型HCV感染患者SVR率最低[3，4]。因此，亟需尋找新的抗HCV藥物靶點(diǎn)和研制新的抗HCV藥物。長期以來，由于一直缺乏有效的HCV體外培養(yǎng)模型和小動(dòng)物模型嚴(yán)重阻礙了HCV致病機(jī)制的研究、抗HCV藥物體內(nèi)作用效果的評價(jià)和保護(hù)性疫苗的研發(fā)。因此探索建立有效的HCV模型，包括HCV體外培養(yǎng)細(xì)胞模型和HCV小動(dòng)物模型，具有十分重要的意義。
　　 就目前國

3、內(nèi)外的研究成果來看，HCV體外培養(yǎng)細(xì)胞模型主要采用的是2005年日本學(xué)者Wakita等人[5]建立的體外轉(zhuǎn)錄模型，該模型存在操作繁瑣、穩(wěn)定性差等缺陷，限制了它的應(yīng)用。HCV小動(dòng)物模型進(jìn)展比較緩慢，比較成功的是人肝嵌合uPA-SCID小鼠模型[6]，但是由于該小鼠出生時(shí)肝臟損傷嚴(yán)重，致使成活率較低，而用于移植的人肝又不易獲得，這使該模型局限于少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，無法滿足日趨緊迫的HCV研究的需要。
　　 正是基于以上的原因，本研究建

4、立了一種基于核酶自剪切機(jī)制的穩(wěn)定分泌HCV細(xì)胞模型，并用核酶自剪切載體對HCV小鼠模型進(jìn)行了探索性研究。
　　 具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、HCV蛋白多克隆抗體的制備。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，原核表達(dá)六個(gè)HCV不同的蛋白片段，以表達(dá)純化的蛋白為抗原，分別免疫新西蘭大耳白兔，收集血清，制得六個(gè)針對HCV不同蛋白片段的多克隆抗體。
　　 2、HCV核心蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，在真核表達(dá)載體pEGFP-N1

5、多克隆位點(diǎn)(MCS)前引入原核啟動(dòng)子lac promoter序列，得到穿梭表達(dá)載體pEGFP-N1-lac，再把PCR擴(kuò)增出的HCV核心蛋白序列(573bp)插入到構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體MCS區(qū)，得到重組質(zhì)粒pEGFP-N1-lac-core，該質(zhì)粒在原核細(xì)胞(E.coli)和真核細(xì)胞(HepG2)中均能表達(dá)HCV核心蛋白，可以作為實(shí)驗(yàn)中HCV蛋白檢測的陽性對照。
　　 3、重組質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB的構(gòu)建。應(yīng)用突變PCR的

6、方法，在原始克隆pJFH1/GDD的HCV全長基因組cDNA的兩端各加入一個(gè)核酶序列，并通過合適的酶切位點(diǎn)把兩端含有核酶的HCV全長cDNA連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1的CMV啟動(dòng)子下游，得到目的質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB。此外，將上述重組質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB中HCV NS5B基因(編碼產(chǎn)物為RNA依賴的RNA聚合酶)中GDD的堿基序列突變?yōu)镚ND，使表達(dá)產(chǎn)物失去RNA聚合酶活性，得到陰性對照質(zhì)粒pJFH1/GND-

7、2RB。
　　 4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。pJFH1/GDD-2RB及其對照質(zhì)粒pJFH1/GND-2RB轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，加入G418溶液至終濃度為0.7mg/ml(為預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳篩選濃度)，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選。2個(gè)星期后，每孔均有大量細(xì)胞死亡，但是整合入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞存活下來并分裂增殖。隨后采用有限稀釋法把存活下來的細(xì)胞倍比稀釋鋪于96孔板，最后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，其中pJFH1/GDD-

8、2RB穩(wěn)定克隆命名為HepG2/GDD，pJFH1/GND-2RB穩(wěn)定克隆命名為HepG2/GND。
　　 5、細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCV RNA的檢測。根據(jù)深圳匹基公司HCV PCR熒光定量檢測試劑盒操作流程，提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的RNA，提取的RNA經(jīng)RNase-freeDNaseⅠ處理，以去除基因組DNA的污染。然后經(jīng)過酚抽得到純凈的RNA，按照試劑盒配制25μl反應(yīng)體系，應(yīng)用Roche Lightcycler2.0完成反應(yīng)。結(jié)果

9、顯示HepG2/GDD培養(yǎng)上清中含有HCV RNA，參照標(biāo)準(zhǔn)品，其滴度達(dá)到1×107，陰性對照(HepG2/GND培養(yǎng)上清)和空白對照(水)中均沒有檢測到HCV RNA。
　　 6、間接免疫熒光檢測HCV核心蛋白的表達(dá)。消化細(xì)胞HepG2/GDD和原始HepG2細(xì)胞(空白對照)，鋪于抗原片上，待細(xì)胞貼壁后，用37℃預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10min，然后用4％的多聚甲醛(PBS稀釋)室溫固定30min，洗滌(洗滌方式同上)。

10、再用0.2％Triton X-100(PBS稀釋)浸泡5min以增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，洗滌。用山羊血清室溫封閉固定好的細(xì)胞30min，PBS清洗后，加入1:400稀釋的抗HCV核心蛋白單抗，37℃孵育1h，洗滌，加入1:1000稀釋的FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，洗滌后加入含有DAPI(4'，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)的封片劑，熒光倒置顯微鏡下觀察到HepG2/GDD細(xì)胞胞漿區(qū)域有較強(qiáng)熒光出現(xiàn)，而

11、空白對照則無此現(xiàn)象，由此表明，HepG2/GDD細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)。
　　 7、蛋白免疫印跡檢測HCV核心蛋白的表達(dá)。收集HepG2/GDD和原始HepG2細(xì)胞，裂解緩沖液裂解后離心取上清，按照4:1的體積比加入5倍上樣緩沖液，沸水浴15分鐘。上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)至PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上，5％脫脂牛奶37℃封閉2h，抗HCV核心蛋白單抗4℃孵育過夜，HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG37℃孵

12、育1h，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光于膠片上，觀察到HepG2/GDD泳道有條帶產(chǎn)生，大小與陽性對照相似，而空白對照(HepG2細(xì)胞)無條帶呈現(xiàn)。
　　 8、HCV病毒顆粒的電鏡觀察。收集HepG2/GDD細(xì)胞培養(yǎng)上清(約15ml)，慢慢攪動(dòng)并加入NaCl至終濃度0.5mol/L，再加入PEG6000至終濃度為10％，4℃過夜。8000rpm離心30min，收集沉淀，溶于100μl PBS中。用細(xì)滴管吸取一滴樣品懸液，滴于銅網(wǎng)上，進(jìn)行

13、負(fù)染操作。完成負(fù)染后，置于電子顯微鏡(Philips，TECNAI-10)下，觀察到HCV顆粒，直徑約為55nm。
　　 9、干擾素治療。把HepG2/GDD細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同劑量的IFN-α至終濃度為10U/ml、100U/ml、500U/ml。3d后收集細(xì)胞上清，提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測病毒滴度，發(fā)現(xiàn)病毒滴度隨干擾素濃度升高而降低，預(yù)示該細(xì)胞模型可以用來抗HCV藥物的篩選。
　　 10、HCV轉(zhuǎn)

14、染小鼠模型探索研究。通過高壓水動(dòng)力法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C57小鼠肝臟細(xì)胞，3天后處死小鼠，收集血清并取肝。用實(shí)時(shí)定量PCR的方法沒有檢測到血清中含有HCV RNA，免疫組化檢測小鼠肝臟中HCV核心蛋白發(fā)現(xiàn)，在血管周圍細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)。
　　 通過上述一系列的研究，我們成功構(gòu)建了質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB，通過把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，然后G418加壓篩選，獲得了整合有該質(zhì)粒的細(xì)胞系HepG2/GDD，該細(xì)胞系能夠有效表