HCV核心蛋白長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型的建立.pdf

1、丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。丙型肝炎病毒感染是造成慢性肝炎，肝硬化及肝癌的主要原因之一，全球大約有1.7億人感染HCV。目前尚無(wú)有效的防治方法，IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療是臨床上標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，但只對(duì)不到50％的患者有效。
　　 HCV是一單股正鏈RNA病毒，病毒基因組全長(zhǎng)9600bp，含有一個(gè)大的開放讀碼框(open reading region，ORF)。它編碼一個(gè)多聚蛋白前體，經(jīng)宿主信號(hào)肽酶和病毒基因編碼

2、的蛋白酶切割產(chǎn)生4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白、包膜蛋白E1、E2和P7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。核心蛋白是HCV編碼的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白，位于整個(gè)多聚蛋白的N-末端，是病毒核衣殼的組成部分，在不同型的HCV中具有高度的保守性。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明核心蛋白與HCV感染所致肝細(xì)胞癌的發(fā)生有密切關(guān)系。但由于HCV具有極強(qiáng)的宿主特異性，目前對(duì)HCV及核心蛋白的機(jī)制和功能的研究多在細(xì)胞模型，缺乏合適的

3、小動(dòng)物模型阻礙了在動(dòng)物整體水平上的研究。
　　 我國(guó)HCV流行株主要為基因1b型，且感染1b型HCV患者運(yùn)用IFN治療效果較差，與肝硬化及肝癌的關(guān)系較為密切。因此研究1b型HCV核心蛋白在HCV持續(xù)感染及肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用，對(duì)防治我國(guó)丙型肝炎具有重要的實(shí)際意義。因此本課題基于成年小鼠，聯(lián)合水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)與噬菌體整合酶系統(tǒng)，建立1b型HCV核心蛋白長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型，作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的補(bǔ)充，并初步將其用于HCV核心蛋白抑制劑

4、-shRNAs在體內(nèi)抗HCV的作用效果的評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建HCV核心蛋白表達(dá)載體pGL3-attB-Core-Fluc。該載體含有核心蛋白基因、報(bào)告基因Fluc和OC31整合酶識(shí)別位點(diǎn)attB。將pGL3-attB-Core-Fluc與對(duì)照載體pGL3-attB-Core、pGL3-attB-Fluc轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，pGL3-attB-Core-Fluc核心蛋白表達(dá)量與pGL3-attB-Core核

5、心蛋白表達(dá)量是一致的，而pGL3-attB-Core-Fluc的Fluc活性卻低于pGL3-attB-Fluc。在C57BL/6小鼠體內(nèi)也證實(shí)了上述結(jié)果。
　　 2.利用OC31整合酶介導(dǎo)位點(diǎn)特異性整合的特點(diǎn)，建立HCV核心蛋白穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型。通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)將核心蛋白表達(dá)載體pGL3-attB-Core-Fluc與編碼OC31整合酶的表達(dá)載體pCMV-int共轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在OC31整合酶作用下，HCV核心蛋白

6、及報(bào)告基因Fluc整合到小鼠肝臟第2號(hào)染色體的mpsL1位點(diǎn)，在小鼠肝臟獲得穩(wěn)定表達(dá)，長(zhǎng)達(dá)420d。
　　 3.在上述動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，對(duì)靶向HCV核心蛋白不同位點(diǎn)的shRNAs進(jìn)行了體內(nèi)作用效果的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)在pSilencerTM2.1-U6 neo載體基礎(chǔ)上，構(gòu)建發(fā)夾型siRNA-shRNA452、shRNA479、shRNA523表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果顯示：在細(xì)胞水平，shRNA-452、shRNA-479和shRNA-523對(duì)核

7、心蛋白和報(bào)告基因Fluc均有抑制作用，抑制率可達(dá)到40-55％；在核心蛋白瞬時(shí)表達(dá)小鼠模型中，shRNA-Fluc和shRNA-523的抑制作用在轉(zhuǎn)染后24 hr已被檢測(cè)到，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用更加明顯。而shRNA-452在轉(zhuǎn)染后48 hr還未出現(xiàn)抑制作用；在核心蛋白穩(wěn)定表達(dá)小鼠模型中，在第6hr、12hr，shRNA523抑制Fluc的活性分別達(dá)到了76.44±26.0％和91.8±8.0％，一次注射該抑制作用持續(xù)24hr。