穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌大鼠模型的建立及栓塞對肝癌肺轉(zhuǎn)移影響的實驗研究.pdf

1、第一部分穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的McA-RH7777細(xì)胞株的建立及生物學(xué)特性評價
　　目的:
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的McA-RH7777細(xì)胞株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行評價。
　　方法:
　　通過對慢病毒載體包裝，將攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhance green fluores-cent protein，EGFP)的慢病毒轉(zhuǎn)染McA-RH7777細(xì)胞株，并進(jìn)行篩選和單克隆化，構(gòu)建出表達(dá)綠色熒光蛋白的單克隆細(xì)

2、胞株:McA-RH7777/EGFP。體外多次傳代后檢測該細(xì)胞株熒光表達(dá)的穩(wěn)定性;對McA-RH7777和McA-RH7777/EGFP兩種細(xì)胞株在細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、遷移運動能力、侵襲能力、AFP的表達(dá)及體內(nèi)成瘤方面進(jìn)行觀察，判斷經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后構(gòu)建的細(xì)胞株較McA-RH7777細(xì)胞株的生物學(xué)特性是否改變。
　　結(jié)果:
　　通過慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染McA-RH7777細(xì)胞株實驗過程順利，經(jīng)過篩選和單克隆化建立的McA-RH77

3、77/EGFP細(xì)胞株，能夠體外穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。經(jīng)過180天體外培養(yǎng)后，仍能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)率達(dá)到100％;細(xì)胞形態(tài)較轉(zhuǎn)染前未發(fā)生改變。McA-RH7777/EGFP細(xì)胞株的生長曲線、細(xì)胞周期、遷移運動能力、侵襲能力、AFP的表達(dá)與McA-RH7777細(xì)胞株基本一致。將McA-RH7777/EGFP細(xì)胞注入Buffalo大鼠皮下，建立皮下瘤，顯示成瘤率、腫瘤生長趨勢與McA-RH7777細(xì)胞基本一致。
　　

4、結(jié)論:
　　通過慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法建立起來的McA-RH7777/EGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，細(xì)胞生物學(xué)特性與母系細(xì)胞株基本一致，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供了一個良好的細(xì)胞株。
　　第二部分穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌大鼠模型的建立及相關(guān)特性評價
　　目的:
　　建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌大鼠移植瘤模型，并評價該模型的生物學(xué)特性，為肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、介入治療等研究提供一個重要的動物模型。
　　方

5、法:
　　利用McA-RH7777/EGFP細(xì)胞株皮下注射成瘤后，制備瘤塊。取30只Buffalo大鼠，開腹直視下，將瘤組織塊種植到肝臟。造模后第7天行MRI掃描檢查肝內(nèi)成瘤率。觀察荷瘤鼠的生物學(xué)特征變化，了解其轉(zhuǎn)移特性;在小動物成像儀及熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)的穩(wěn)定性及評價熒光在腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究中的優(yōu)勢;病理學(xué)及免疫印跡分析觀察腫瘤組織特點及腫瘤指標(biāo)的表達(dá)情況;行MRI、CT、DSA檢查來評價該腫瘤模型的影像學(xué)特點。
　　

6、結(jié)果:
　　該模型造模成功率高，達(dá)到100％。大鼠生存期為45.93±5.06天。大鼠肝內(nèi)腫瘤體積第7天時為12.54±3.89 mm3，14天時201.18±86.39 mm3，較前明顯增大，之后增長迅速。終末期觀察該肝癌模型具有高肺轉(zhuǎn)移特性，腫瘤組織熒光表達(dá)穩(wěn)定，在熒光顯微鏡下可以清楚的區(qū)分腫瘤病灶，病理符合肝癌表現(xiàn)。AFP表達(dá)陽性。腫瘤在MRI上T1WI上成像稍低或等信號，而在T2WI上呈高信號;CT顯示肝內(nèi)病灶為低密度，肺

7、部多發(fā)結(jié)節(jié)狀轉(zhuǎn)移灶;DSA造影顯示肝內(nèi)腫瘤供血動脈增粗，血管扭曲，腫瘤染色明顯，與人類肝癌影像學(xué)表現(xiàn)相似。
　　結(jié)論:
　　穩(wěn)定表達(dá)EGFP的肝癌Buffalo大鼠移植瘤模型和人類的肝癌的生物學(xué)特性接近，具有成瘤率高、重復(fù)性強、高肺轉(zhuǎn)移等特性，熒光表達(dá)穩(wěn)定，適合用于肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、介入治療、影像診斷、新藥篩選等方面的實驗研究。
　　第三部分大鼠移植性肝癌模型腫瘤分期的初步探討
　　目的:
　　通過觀察穩(wěn)定表

8、達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型腫瘤的進(jìn)展過程，確定大鼠肝癌模型的腫瘤分期，探討微轉(zhuǎn)移期的時間窗。
　　方法:
　　利用McA-RH7777/EGFP細(xì)胞株皮下注射成瘤后，制備瘤塊。取35只Buffalo大鼠，開腹直視下，將瘤組織塊種植到肝臟，造成大鼠肝癌模型。觀察大鼠的生物學(xué)行為，并根據(jù)該模型的生長特點及大鼠腫瘤的進(jìn)展情況，于7、12、18、21、26天分別處死7只大鼠，利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)熒光的特點，在熒光顯微鏡下

9、準(zhǔn)確的觀察肝內(nèi)腫瘤生長情況、肺轉(zhuǎn)移情況。在處死大鼠時取下腔靜脈血，流式細(xì)胞儀檢測大鼠循環(huán)腫瘤細(xì)胞的變化，并檢測肝功能中白蛋白的變化。通過綜合上述因素，來確定大鼠的腫瘤分期。
　　結(jié)果:
　　造模后7天，行MRI掃描，Buffalo大鼠肝內(nèi)均有腫瘤，造模成功。造模后大鼠體重7天內(nèi)增長不明顯，之后開始增加;至21天體重增加不明顯，隨后開始下降。肝內(nèi)腫瘤第7天時為13.36±2.90 mm3，12天時162.5±69.71mm3，

10、26天達(dá)到1683.36±375.02mm3。觀察肝外轉(zhuǎn)移情況:21天時肺部出現(xiàn)熒光顯微鏡下可見的小轉(zhuǎn)移灶，之前肺部未見轉(zhuǎn)移灶;26天時肺部出現(xiàn)肉眼可見多發(fā)小轉(zhuǎn)移灶。循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn):第7天未能檢測到腫瘤細(xì)胞，12天腫瘤細(xì)胞數(shù)為(8.14±1.21)/106，18天時腫瘤細(xì)胞數(shù)為(15.43±3.99)/106，P＜0.05。肝功能檢測發(fā)現(xiàn)26天時ALB為28.8±2.85 g/L，較前下降，P＜0.05。
　　結(jié)論:

11、　　在穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌Buffalo大鼠模型上從12天到18天可定義為微轉(zhuǎn)移期肝癌，21天后為晚期肝癌。該分期情況可以為肝癌的動物實驗研究提供一定的參考。
　　第四部分經(jīng)動脈栓塞術(shù)對微轉(zhuǎn)移期肝癌肺轉(zhuǎn)移影響的實驗研究
　　目的:
　　對微轉(zhuǎn)移期的肝癌大鼠進(jìn)行經(jīng)動脈栓塞治療，探討栓塞治療對于該時期肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響，并對其機制進(jìn)行初步研究，為臨床更科學(xué)的設(shè)計治療方案提供參考。
　　方法:
　　取40只B

12、uffalo大鼠，開腹直視下，將瘤組織塊種植到肝臟，建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的肝癌大鼠模型。造模后第17天，將大鼠隨機分成4組，每組10只，分別為:對照組(A)，開腹胃十二指腸動脈逆行插管成功后，注入生理鹽水0.2ml;肝動脈結(jié)扎組(B)，分離肝動脈后采用縫線結(jié)扎;小劑量栓塞組(C)，胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油(0.2ml/kg);大劑量栓塞組(D):胃十二指腸動脈逆行插管，注入超液化碘油（0.4ml/kg）。術(shù)后隨訪體重及

13、腫瘤變化，三周后處死所有大鼠，收集肝和肺標(biāo)本，觀察腫瘤生長變化及肺轉(zhuǎn)移情況。通過進(jìn)行Real time PCR、Western-blot、免疫組化來檢測腫瘤組織中的VEGF、E-cadherin、ICAM-1在mRNA及蛋白水平表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:
　　術(shù)后第7、14、21天，記錄肝內(nèi)腫瘤情況顯示:D組明顯抑制肝臟腫瘤生長，B、C組相對于對照組也有抑制生長。觀察肺轉(zhuǎn)移:D組肺轉(zhuǎn)移個數(shù)相對較少。
　　通過RT-PCR

14、比較各組VEGF mRNA的相對表達(dá)量:B、C、D組的VEGFmRNA相對表達(dá)量，分別為2.53±0.28、2.46±0.32、1.95±0.17，均較A組(0.93±0.29)表達(dá)量高，有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。Western-blot分析VEGF結(jié)果顯示:A組為0.17±0.01，較B(0.28±0.05)、C(0.27±0.07)、D(0.21±0.04)三組表達(dá)低，有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。免疫組化染色記錄陽性細(xì)胞數(shù)百分比顯

15、示A、B、C、D四組分別為:46.8±6.05、63.8±7.09、61.3±3.82、51.4±4.5，相互比較發(fā)現(xiàn):A組較B、C組低，P值均小于0.04;但A、D之間無顯著差異，P＞0.05。腫瘤內(nèi)CD31標(biāo)記的陽性血管數(shù)顯示:B(57.1±6.9)、C(52.3±2.7)組較A(43.3±3.7)、D(45.5±3.5)組高，有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。
　　通過RT-PCR分析四組E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量

16、:D組(1.66±0.38)較A(0.99±0.39)、B(0.80±0.23)、C(0.86±0.24)三組表達(dá)增高，均有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。Western-blot分析E-cadherin結(jié)果顯示A、B、C、D四組分別為:0.13±0.06、0.12±0.04、0.13±0.03、0.32±0.09，D組較A、B、C三組高，有統(tǒng)計學(xué)意義，P值均小于0.003。免疫組化染色計數(shù)陽性細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)結(jié)果同Western-blot結(jié)果相似

17、。
　　通過RT-PCR分析ICAM-1 mRNA的相對表達(dá)量顯示A、B、C、D四組分別為:1.09±0.19、1.12±0.16、0.97±0.23、0.69±0.16，D組較其他三組降低，P＜0.05。Western-blot分析ICAM-1結(jié)果顯示:D組(0.27±0.05)較A(0.41±0.08)、B(0.44±0.09)、C(0.40±0.06)三組降低，P＜0.05。
　　結(jié)論:
　　在大鼠肝癌模型上，經(jīng)