農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化及綠色熒光蛋白的表達(dá)研究.pdf

1、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是一種腐生性絲狀真菌，具有良好的合成和分泌蛋白的能力，可以用于纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多種酶類的生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，瑞氏木霉作為低等真核生物具有結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，也是研究真菌遺傳、代謝作用的重要生物材料。 目前，瑞氏木霉全基因組測序工作已經(jīng)完成，促進(jìn)了瑞氏木霉功能基因組學(xué)的發(fā)展。建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在基因組范圍內(nèi)進(jìn)行T

2、-DNA隨機(jī)插入突變，建立瑞氏木霉的突變體庫，利用正、反向遺傳學(xué)方法對(duì)不同表型突變體進(jìn)行基因水平的研究，獲得與突變性狀相關(guān)的基因?？刂浦匾誀罨蚬δ艿年U明有助于深入了解瑞氏木霉特有的生命現(xiàn)象，對(duì)瑞氏木霉分子生物學(xué)研究和指導(dǎo)菌株遺傳改造具有重要作用。 綠色熒光蛋白作為一種新型的標(biāo)記基因，被廣泛用做原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的報(bào)告基因。在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可高效發(fā)射清晰可見的綠色熒光，具有穩(wěn)定、靈敏度高且無需底物或輔助因子參與等優(yōu)點(diǎn)。

3、自綠色熒光蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中成功表達(dá)后，綠色熒光蛋白及其他熒光蛋白己得到廣泛的應(yīng)用，包括對(duì)多種真菌的研究，以綠色熒光蛋白作為分子標(biāo)記有利于對(duì)瑞氏木霉基因表達(dá)和蛋白定位等諸多方面的研究。 本文成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉T-DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌AGL1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化瑞氏木霉QM9414，得到一批瑞氏木霉T-DNA插入突變株。將來自于質(zhì)

4、粒pAN7-1的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)表達(dá)盒插入到Ti質(zhì)粒pBI121中，構(gòu)建了雙元載體pBI-hph。將該雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1后，與瑞氏木霉孢子或原生質(zhì)體共培養(yǎng)，在含潮霉素平板上得到抗性轉(zhuǎn)化子。通過PCR和斑點(diǎn)雜交分子驗(yàn)證，表明T-DNA上的hph基因已插入到瑞氏木霉轉(zhuǎn)化子染色體中。利用TAIL-PCR方法，從轉(zhuǎn)化子中成功克隆到T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，序列測序結(jié)果證明T-DNA隨機(jī)插入到瑞氏木霉染色體中。目前已經(jīng)篩

5、選得到經(jīng)過分子驗(yàn)證的突變株200余株，證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種有效的隨機(jī)插入突變方法，對(duì)于瑞氏木霉功能基因組學(xué)研究具有重要意義。為實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白在瑞氏木霉中的表達(dá)，本文將Pig1783質(zhì)粒中的綠色熒光蛋白基因(egfp)表達(dá)盒片段與含乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因(pyrG)的質(zhì)粒Pab4-1共轉(zhuǎn)化瑞氏木霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型突變株M23，經(jīng)PCR驗(yàn)證篩選得到2株轉(zhuǎn)化子。RT-PCR和SDS-PAGE分析結(jié)果表明egfp基因在這2株

6、瑞氏木霉轉(zhuǎn)化子中都能成功轉(zhuǎn)錄和翻譯。熒光觀察結(jié)果顯示在瑞氏木霉菌絲和孢子中都可以觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光。 在進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，為克服以潮霉素作為篩選標(biāo)記存在的篩選背景高，篩選效率低等問題，以Ti質(zhì)粒Pcmbia0390為骨架構(gòu)建了攜帶乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶(pyrG)單選擇標(biāo)記基因的雙元載體Pcmbia-P，以及egfp和pyrG雙選擇標(biāo)記基因的雙元載體Pcmbia-OEP，以便比較不同載體在轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用效果

7、。將雙元載體Pcmbia-P導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105后，在乙酰丁香酮誘導(dǎo)下，含雙元載體Pcmbia-P的農(nóng)桿菌與T.reesei M23共培養(yǎng)，初步篩選得到20余株轉(zhuǎn)化子。PCR驗(yàn)證結(jié)果表明pyrG基因已經(jīng)插入到轉(zhuǎn)化子染色體中。含雙元載體Pcmbia-OEP的農(nóng)桿菌與T.reesei M23共培養(yǎng)后篩選得到了12株目的轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子菌絲進(jìn)行的熒光檢測，可以觀察到綠色熒光，證明AMT轉(zhuǎn)化成功，T-DNA確實(shí)插入到T.reesei染色體上且