Sorafenib對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其干預(yù)—實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、手術(shù)切除是原發(fā)性肝癌最有效的治療方法，但即使根治術(shù)后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60-70％。對(duì)不能切除的肝癌和肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)防，抗血管生成是一條可探索的途徑，但新近的報(bào)道，抗血管生成也可促進(jìn)轉(zhuǎn)移。分子靶向藥物sorafenib是目前唯一經(jīng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)證實(shí)提高晚期肝癌病人生存期的藥物，但僅延長3個(gè)月生存期；在東方晚期肝癌病人的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，sorafenib雖延長生存期，但僅推遲腫瘤進(jìn)展。作為包括抗血管生成作用的sorafenib是否也

2、有促進(jìn)癌轉(zhuǎn)移的作用，也是需要弄清的問題。
　　本文用不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型，研究sorafenib治療過程中腫瘤進(jìn)展的原因，以及對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。鑒于腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞及其所處微環(huán)境有關(guān)，在肝癌中也發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中的炎癥因子、巨噬細(xì)胞可預(yù)測(cè)肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。為此，本文擬從腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞兩個(gè)方面進(jìn)行研究，并探索進(jìn)一步提高sorafenib療效的途徑。
　　1.低劑量sorafenib誘導(dǎo)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛

3、能增強(qiáng)
　　本部分工作的主要目的是在不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌裸鼠模型中，探索不同劑量sorafenib對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。首先在我所高轉(zhuǎn)移人肝癌裸鼠模型(LCI-D20)中，發(fā)現(xiàn)sorafenib低劑量(30mg/kg)和高劑量(100mg/kg)均明顯抑制腫瘤生長，并延長荷瘤鼠生存期。Sorafenib雖抑制肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，但并未降低肺轉(zhuǎn)移率；而考慮到soraferu|b治療組腫瘤體積更小，以標(biāo)化肺轉(zhuǎn)移率(肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目/腫瘤體積

4、)計(jì)算，sorafenib治療組有促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移趨勢(shì)(sorafenib低劑量組與對(duì)照組比較，P=0.069)。研究還發(fā)現(xiàn)sorafenib低劑量(30mg/kg)明顯促進(jìn)肝內(nèi)播散。盡管sorafenib大劑量(100mg/kg)組在用藥期間未觀察到促轉(zhuǎn)移，但治療一周后停藥，總體生存更差，在對(duì)照組小鼠全部死亡之前，大劑量組小鼠都已死亡。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證此現(xiàn)象，我們以低劑量sorafenib(30mg/kg)在熒光標(biāo)記的不同轉(zhuǎn)移潛能

5、的人肝癌裸鼠原位模型LM3-RFP(高轉(zhuǎn)移潛能，簡稱LM3)和HepG2-GFP(低轉(zhuǎn)移潛能，簡稱HepG2)中重復(fù)此試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低劑量somfenib(30mg/kg)明顯促進(jìn)肝內(nèi)播散，且不降低LM3模型腹腔轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移率。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血腫瘤細(xì)胞(circulating Rlnlor cells，CTC)，發(fā)現(xiàn)低劑量sorafenib(30mg/kg)明顯促進(jìn)CTC增多。
　　2.乏氧導(dǎo)致上皮.間質(zhì)轉(zhuǎn)化是sorafen

6、ib促侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)理
　　我們通過免疫組化染色內(nèi)源性乏氧標(biāo)記物乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α)和外源性乏氧標(biāo)記物哌莫硝唑(Pimodazole)發(fā)現(xiàn)sorafenib治療組腫瘤組織明顯乏氧。乏氧可通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移，因此我們?cè)贚M3和HepG2模型中，分別以免疫組化染色EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，發(fā)現(xiàn)so

7、rafenib顯著下調(diào)E-cadherin，同時(shí)上調(diào)N-eadherin和Vimentin，提示sorafenib治療后腫瘤發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且侵襲性增強(qiáng)。
　　3.Sorafenib治療下調(diào)HTATIP2等抑癌基因?qū)е碌蛲鎏用撌侵匾肿踊A(chǔ)
　　我們發(fā)現(xiàn)sorafenib治療后殘余腫瘤對(duì)凋亡發(fā)生抵抗，“腫瘤信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片”提示6個(gè)抑癌基因HTATIP2、SERPINB5、SYK、Rb1、FAS、P53等和1個(gè)促

8、凋亡基因腫瘤壞死因子(TNF)均下調(diào)，這些下調(diào)的基因均為促凋亡基因，且多數(shù)與P53有關(guān)。逃脫凋亡是惡性腫瘤細(xì)胞的6大特征之一，誘導(dǎo)或促進(jìn)凋亡可抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。為此我們推測(cè)，sorafenib治療后，抗凋亡基因SERPINB5、SYK、Rb1、FAS、HTATIP2、P53、TNF等的下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤逃脫凋亡。
　　4.阿司匹林上調(diào)HTATIP2等，抑制sorafenib的促侵襲轉(zhuǎn)移作用
　　上述研究提示sorafenib

9、治療后，抑癌基因HTATIP2、SERPINB5、Rb1、FAS、P53、TNF等均下調(diào)，這些抗凋亡基因均與P53有關(guān)，且促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。而aspirin具有上調(diào)P53和促凋亡作用，為此探索合用aspirin是否可通過P53作為Sorafenib的增敏劑。研究結(jié)果表明，合用aspirin后顯著抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，肝內(nèi)播散灶消失，生存期延長?；蛩綑z測(cè)幾種抑癌基因，發(fā)現(xiàn)aspirin僅顯著上調(diào)HTATIP2-mRNA，但對(duì)P53-mRNA

10、無影響。蛋白水平檢測(cè)證實(shí)aspirin上調(diào)HTATIP2蛋白。
　　我們推測(cè)sorafenib誘導(dǎo)的肝內(nèi)播散灶增多和aspirin逆轉(zhuǎn)sorafenib促肝內(nèi)播散增多可能主要通過HTATIP2發(fā)揮作用。為此選擇慢病毒下調(diào)的方法，得到慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shHTATIP2的細(xì)胞株LM3-LV-shHTATIP2和轉(zhuǎn)染相應(yīng)空載體對(duì)照細(xì)胞株LM3-LV-shNon，發(fā)現(xiàn)LM3-LV-shHTATIP2腫瘤相比LM3-LV-shNon腫瘤邊界不

11、清，提示局部侵襲性更強(qiáng)，LM3-LV-shHTATIP2腫瘤相比LM3-LV-shNon腫瘤，在sorafenib治療下促進(jìn)肝內(nèi)播散的作用較弱，而合用aspirin后對(duì)sorafenib誘導(dǎo)的肝內(nèi)播散的抑制作用也較弱(合用aspirin+sorafenib相比單用sorafenib，在LM3-LV-shHTATIP2腫瘤降低50％的肝內(nèi)播散；而在LM3-LV-shNon腫瘤中降低100％肝內(nèi)播散)。另外合用aspirin+sorafen

12、ib對(duì)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用，在LM3-LV-shHTATIP2腫瘤中也較LM3-LV-shNon腫瘤中更弱。
　　5.體外用aspirin與sorafenib合用觀察促凋亡作用
　　體外實(shí)驗(yàn)以sorafenib5μM作用于LM3細(xì)胞，選擇不同時(shí)間點(diǎn)(0h、3h、6h、12h、24h)觀察sorafenib對(duì)HTATIP2-mRNA的作用。發(fā)現(xiàn)sorafenib5μM明顯下調(diào)HTATIP2-mRNA；選擇aspirin0.1mM/

13、0.5mM作用于細(xì)胞株LM3-LV-shHTATIP2、LM3-LV-shNon和LM3-wt，選擇不同時(shí)間點(diǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)aspirin0.1 mM/0.5 mM均明顯上調(diào)HTATIP2-mRNA和HTATIP2蛋白；合用sorafenib5μM+aspirin0.1mM/0.5mM明顯逆轉(zhuǎn)sorafenib5μM對(duì)HTATIP2的抑制作用。Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，sorafenib+aspirin明顯增強(qiáng)sorafen

14、ib對(duì)LM3-wt和LM3-LV-shHTATIP2的促凋亡作用。因此證明Naspirin主要通過上調(diào)HTATIP2增強(qiáng)Sorafenib的促凋亡作用。
　　6.巨噬細(xì)胞抑制劑減少sorafenib誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤而增效
　　在血漿和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)sorafenib治療組巨噬細(xì)胞趨化因子VEGF、SDF-1α和CSF-1明顯升高，伴隨腫瘤組織中F4/80和CD11b陽性巨噬細(xì)胞浸潤明顯增多，以及外周血中F4/80和CD11

15、b陽性細(xì)胞數(shù)目增多。合用巨噬細(xì)胞抑制劑唑來磷酸和氯磷酸鹽脂質(zhì)體通過減少巨噬細(xì)胞的浸潤進(jìn)一步抑制腫瘤生長，并減少肺轉(zhuǎn)移。本部分工作提示，腫瘤在sorafenib治療過程中導(dǎo)致腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通過分泌VEGF對(duì)抗sorafenib治療作用，可用抑制骨轉(zhuǎn)移藥物唑來磷酸增強(qiáng)sorafenib對(duì)肝癌的抑制作用。
　　結(jié)論
　　1.Sorafenib低劑量在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌原位裸鼠模型中促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　2.Soraf

16、enib的促侵襲轉(zhuǎn)移作用與下調(diào)抑癌基因HTATIP2有關(guān)。
　　3.Aspirin上調(diào)HTATIP2促肝癌細(xì)胞凋亡，有逆轉(zhuǎn)sorafenib的促侵襲轉(zhuǎn)移潛能作用。
　　4.巨噬細(xì)胞抑制劑唑來磷酸通過清除sorafenib誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞而增效。
　　應(yīng)用價(jià)值
　　1.發(fā)現(xiàn)低劑量sorafenib促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)，合用aspirin和sorafenib通過上調(diào)HTATIP2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，

17、為提高sorafenib臨床療效提供線索。
　　2.合用巨噬細(xì)胞抑制劑唑來磷酸可提高sorafenib對(duì)肝癌的抑制作用。
　　3.為今后針對(duì)凋亡通路開發(fā)抗腫瘤藥物，或?yàn)閷ふ襰orafenib的合用藥物提供依據(jù)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.在人肝癌原位裸鼠模型發(fā)現(xiàn)sorafenib通過下調(diào)HTATIP2促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能。
　　2.發(fā)現(xiàn)合用aspirin通過上調(diào)HTATIP2促進(jìn)凋亡和抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)sor