HCV小鼠模型的建立及其在肝臟免疫損傷研究中的應用.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis CVirus，HCV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，是慢性肝炎的主要致病因子之一。臨床資料顯示，丙肝患者的肝細胞極易發(fā)生損傷，且肝細胞的自身修復能力減弱、增生異常，最終引發(fā)肝纖維化、肝硬化及肝癌的發(fā)生，迄今仍缺乏有效的防治手段。加強丙型病毒性肝炎的相關基礎研究，是當前丙型病毒性肝炎防治研究中的重要命題。
　　HCV是一種非細胞毒性的嗜肝病毒，丙肝患者肝細胞極易發(fā)生損傷的現象主要是由宿主免疫系統與

2、受病毒感染的肝細胞間的相互作用引起。特別是宿主肝臟免疫系統對被感染肝實質細胞的異常免疫反應導致了肝細胞損傷與修復的平衡失調。但HCV和宿主肝臟免疫系統間相互作用的機制尚不明確，探索HCV和宿主肝臟免疫系統之間的相互作用是本研究的重要目的。
　　本研究分以下兩個部分展開:
　　1.肝臟特異性穩(wěn)定轉染技術的探索與應用
　　合適的動物模型是探索HCV免疫致病機理的重要環(huán)節(jié)。目前，可感染HCV的動物模型僅限于黑猩猩、嵌合人類肝

3、細胞小鼠模型及多種HCV受體聯合轉基因小鼠模型。但由于受數量有限、價格昂貴等因素的影響，限制了這幾類動物模型在基礎研究中的廣泛應用。傳統的HCV轉基因小鼠模型為研究HCV蛋白與宿主之間的相互作用奠定了良好的基礎，但由于存在先天免疫耐受，使其不能應用于HCV和肝臟免疫系統間的相互作用研究?；诖?，采用合適的方法建立免疫功能正常并適于實驗室廣泛應用的HCV動物模型是目前抗HCV相關研究的重要環(huán)節(jié)。
　　1.1眼底靜脈叢水動力轉染技術的

4、建立
　　基于經典的水動力轉染技術和眼底靜脈叢注射技術建立的眼底靜脈叢水動力轉染技術具有良好的肝臟靶向性，在目前缺乏合適的HCV小動物模型的前提下，通過該方法建立HCV小鼠模型替代HCV體內感染模型可能是一種快速、高效、穩(wěn)定、簡便的構建HCV肝臟特異性轉基因動物模型的新方法。傳統的水動力轉染技術有其自身難以克服的缺點，因此，本研究結合眼底靜脈叢輸注建立了眼底靜脈叢水動力轉染技術。該技術是將大量含有目的基因表達質粒的鹽水溶液從眼底靜

5、脈快速注入實驗動物體內，實現外源基因在肝臟特異、高效表達。通過條件摸索，確立了應用該技術的最適轉染條件，并分析了其對實驗動物器官機能的影響。在轉染效率方面，眼底靜脈叢水動力轉染技術與經典的尾靜脈水動力轉染技術相當。該技術操作更簡單、可重復性強。最為關鍵的是，眼底靜脈叢水動力轉染技術克服了尾靜脈水動力轉染僅能用于尾靜脈適合注射的實驗動物的應用限制。該技術除可用于常規(guī)實驗動物外，還可用于尾靜脈無法注射或無尾靜脈的實驗動物，有效拓展了水動力轉

6、染技術的應用范圍。
　　1.2密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶介導外源基因在小鼠肝臟長期穩(wěn)定表達
　　噬菌體整合酶技術是一種可以介導外源基因在靶細胞發(fā)生特異性整合的生物酶技術。新近報道的鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶針對鼠類基因特點進行密碼子優(yōu)化，對于鼠源細胞具有更高的整合效率。
　　為促進水動力轉染技術導入肝組織中的外源基因在小鼠肝細胞中長期穩(wěn)定表達，我們在實驗中引入鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶技術。并以NF-κB sensor質

7、粒作為報告基因，通過與噬菌體整合酶表達質粒共轉染實現對活體小鼠肝臟長期穩(wěn)定轉染的技術優(yōu)化，建立了可長期監(jiān)測肝臟NF-κB活性的小動物模型。研究結果顯示，與傳統的噬菌體整合酶系統相比，鼠密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶可以更加有效的促使外源基因在活體小鼠肝細胞中發(fā)生整合，并介導外源基因長期高效表達。
　　1.3基于水動力轉染和整合酶技術建立HCV基因組肝臟長期表達小鼠模型
　　在前期研究工作基礎上，我們聯合水動力轉染技術和鼠密碼子優(yōu)化

8、的噬菌體整合酶技術，基于免疫功能正常的C57BL/6小鼠，建立了HCV全基因組肝臟長期穩(wěn)定表達的動物模型。此外，在HCV全基因組表達載體上融合了報告基因一螢火蟲熒光素酶，HCV在小鼠肝臟的表達情況可以通過活體成像技術進行實時監(jiān)測，為后續(xù)實驗提供了方便。
　　2.HCV促進小鼠肝臟免疫損傷的機制研究
　　強勢的肝臟免疫系統是機體抵御外來侵襲的重要防御機制。占肝臟淋巴細胞總數30％左右的NK細胞，對抵抗病毒、寄生菌感染和惡性轉化

9、細胞侵潤等侵害具有十分重要的意義。但NK細胞是否參與丙肝患者肝細胞損傷的免疫過程尚不明確。因此本研究尋找以NK細胞為代表的肝臟免疫細胞在丙肝患者肝細胞損傷中的作用機制，可能是防治HCV所導致的肝臟疾病的重要方法。
　　2.1 HCV對小鼠肝臟免疫細胞的影響
　　以本研究建立的免疫功能正常的HCV全基因組肝臟長期表達小鼠模型為基礎，首先分析HCV表達對肝臟免疫細胞的影響，結果顯示:HCV降低了小鼠肝臟NK細胞的數量，但不影響其

10、活性; HCV對小鼠其他類型的肝臟淋巴細胞（NKT、T、DC等）未造成顯著影響。這一結果與臨床報道相似。
　　2.2 HCV促進Con A誘導的小鼠肝臟損傷及其免疫學機制
　　鑒于NK細胞在肝臟天然免疫系統中發(fā)揮的重要作用，我們認為，肝臟NK細胞的減少可能會對機體的免疫反應產生一定的影響。為進一步探索HCV與宿主肝臟免疫系統的關系，基于該HCV小鼠模型，并結合Con A誘導的自身免疫性肝損傷模型，對HCV免疫致病機理進行探索

11、。結果顯示:中等劑量Con A刺激后，HCV組小鼠的肝臟免疫損傷現象增強;而高劑量Con A刺激后，HCV小鼠發(fā)生嚴重的自身免疫性肝炎并促使小鼠死亡率增高。進一步研究結果顯示:ConA靜脈注射誘發(fā)小鼠自身免疫性肝炎后，小鼠肝臟免疫細胞活化，其中肝臟天然免疫細胞---NK細胞的數量和功能在HCV組和對照組小鼠間的差異最為明顯。選擇性清除小鼠體內的NK細胞，則HCV小鼠對Con A誘導的肝損傷的敏感性降低，肝損傷減輕。說明HCV小鼠對Con

12、 A誘導的肝損傷的敏感性增強與小鼠肝臟NK細胞的過度活化相關。針對NK細胞功能的研究結果顯示，肝臟NK細胞免疫功能過度激活依賴于NK細胞表面激活性受體NKG2D及其胞內與其免疫活性密切相關的細胞因子（IFN-γ、 TNF-α等）的表達。同時，NKG2D在肝細胞表面的配體NKG2DL(H60)的表達水平也顯著上調。
　　綜上所述，本研究結合眼底靜脈叢水動力轉染技術、密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶和活體熒光成像技術，基于免疫功能正常的C57

13、BL/6小鼠，建立了可視化的HCV肝臟特異性長期表達小鼠模型。研究顯示，該模型對Con A誘導的肝損傷更加敏感，而這一現象與肝臟NK細胞的異?；罨嚓P，肝臟NK細胞發(fā)揮病理性免疫損傷作用主要是通過NKG2D/NKG2DL(H60)相關信號通路及其胞內與其免疫活性相關的細胞因子（IFN-γ、TNF-α等）的表達。本研究從肝臟天然免疫系統角度部分解釋了HCV和肝臟免疫細胞間的相互關系，對HCV急慢性感染的防控及HCV導致的肝臟疾病的治療具有