Fank1基因敲減小鼠模型的建立及其在雄性小鼠生殖功能中的研究.pdf

1、在現(xiàn)代社會(huì)不育癥己成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病，生殖健康逐漸引起人們的普遍重視。目前，全球大約有15％的夫婦受到不育癥的困擾，導(dǎo)致男性不育最主要的原因是由精子生成障礙引起的[1]。為了從根本上實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育的診療，需要對(duì)精子的發(fā)生過程和機(jī)制有更深入的研究。精子發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，并且在這個(gè)過程中存在許多睪丸特異性的基因表達(dá)，由此產(chǎn)生一些酶類和蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。許多睪丸特異性基因具有發(fā)育階段特異性和組織細(xì)胞特異

2、性等表達(dá)特征，這些特異性基因參與精子發(fā)生過程中特異的細(xì)胞活動(dòng)，如減數(shù)分裂、遺傳物質(zhì)重組和染色質(zhì)的濃縮以及發(fā)育后期的變態(tài)過程。當(dāng)睪丸特異基因出現(xiàn)異常會(huì)導(dǎo)致少精、弱精或精子畸形等現(xiàn)象發(fā)生。
　　 Fank1基因是我們實(shí)驗(yàn)室最新篩查到的一個(gè)睪丸特異表達(dá)基因[7]，該基因位于7號(hào)染色體，是由FnⅢ結(jié)構(gòu)域和5個(gè)錨定蛋白組成的，編碼一種核蛋白，該蛋白是一種睪丸組織特異轉(zhuǎn)錄因子。并且Fank1基因在11種脊椎動(dòng)物中高度保守，其中小鼠和人的Fa

3、nk1基因同源性高達(dá)85％，說明該基因在精子發(fā)生過程中具有重要的生理作用。Fank1基因在精子發(fā)生過程的減數(shù)分裂到單倍體階段廣泛表達(dá)，研究其特性和功能對(duì)揭示精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育及開發(fā)避孕藥物等方面有重要意義。因此通過RNA干擾的方法建立Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠不育模型，并對(duì)基因敲減小鼠模型進(jìn)行傳代功能分析和表型分析，來進(jìn)一步研究Fank1基因在精子發(fā)生過程中的功能及其在男性不育中的作用及意義。

4、　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、人胚腎細(xì)胞系293T
　　 2、SPF級(jí)C57BL/6小鼠、B6D2F1小鼠和ICR小鼠
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
　　 4、分子克隆及PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
　　 5、RT-PCR、Real-time PCR和microRNA提取等相關(guān)試劑
　　 6、Southern blot、Western blot等相關(guān)試劑

5、　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、Fank1干擾載體的構(gòu)建及在細(xì)胞水平的鑒定
　　 （1）pSUPER-shFank1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和pDsRed-Fank1融合表達(dá)構(gòu)件的制備
　　 根據(jù)Fank1基因cDNA序列，應(yīng)用http：//www.dharmacon.com/在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)2條干擾序列，分別克隆至帶有H1啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體pSUPER-neo-GFP中，同時(shí)從成年C57BL/6小鼠睪丸組織擴(kuò)增Fank1基

6、因全序列，構(gòu)建Fank1基因與紅色熒光蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-Fank1。
　　 （2）將上述兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別應(yīng)用熒光檢測(cè)、RT-PCR和Western blot等方法檢測(cè)Fank1干擾載體干擾效率。
　　 2、Fank1基因敲減小鼠模型的建立
　　 （1）選取干擾效率高的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)單酶切后，采用凝膠純化試劑盒純化，通過顯微注射的方法注射到BDF1小鼠受精卵中，將注射基因的受精卵

7、移植到假孕母鼠輸卵管內(nèi)，利用PCR和Southern blot方法對(duì)仔鼠進(jìn)行檢測(cè)。
　　 （2）Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠繁育。
　　 3、Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析
　　 （1）提取Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織microRNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Fank1 siRNA在基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織的表達(dá)情況。
　　 （2）通過RT-PCR、Real-time PCR和Wester

8、n blot方法檢測(cè)Fank1基因在基因敲減小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。
　　 （3）對(duì)Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的睪丸重量、精子的數(shù)量進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
　　 （4）Fank1基因敲減轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠交配，比較產(chǎn)仔數(shù)量及產(chǎn)仔周期并進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定含干擾序列的重組質(zhì)粒pSUPER-shFank1631＃，pUPER-shFank1247＃及p

9、DsRed-Fank1表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果完全正確。
　　 2、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞36h后，熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)shFank1631＃、247＃均能明顯抑制紅色熒光蛋白表達(dá)，抑制效率分別為95％和90％，RT-PCR和Western blot結(jié)果表明Fank1基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都受到顯著抑制（p<0.05）。
　　 3、利用顯微注射法將pSUPER-shFank1631＃注入BDF1小鼠受精卵原核中，共注射285枚胚

10、胎，存活203枚，將注射后存活的受精卵分別移植到8只ICR假孕雌鼠輸卵管內(nèi)，共產(chǎn)仔53只，經(jīng)PCR及Southern blot檢測(cè)后共14只陽性小鼠，陽性率為26.4％。
　　 4、Fank1 siRNA在基因敲減小鼠睪丸組織中均特異表達(dá)。采用半定量RT-PCR檢測(cè)基因敲減小鼠睪丸組織Fank1 mRNA表達(dá)與正常小鼠相比明顯降低。在RT-PCR的基礎(chǔ)上，又采用Real Time-PCR和Western blot的方法檢測(cè)Fan

11、k1基因在基因敲減小鼠的表達(dá)。結(jié)果顯示基因敲減小鼠的Fank1基因表達(dá)量與野生型小鼠比較都有不同程度的降低，其中F01、F02、F011、F045 Founder轉(zhuǎn)基因小鼠Fank1基因表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 5、成年Fank1基因敲減雄性小鼠睪丸組織重量和野生型雄性小鼠睪丸組織重量進(jìn)行比較，無顯著性差異（p>0.05）。
　　 6、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，F(xiàn)ank1基因敲減小鼠精子數(shù)量、產(chǎn)仔周期和產(chǎn)仔數(shù)量與野生型比較均有顯著性差異