睪丸特異轉(zhuǎn)錄因子FANK1的DNA結(jié)合序列的研究.pdf

1、目的：
　　 精子的發(fā)生是一個復(fù)雜的細(xì)胞分化過程,分為3個不同的階段:有絲分裂期、減數(shù)分裂期和單倍體期。在這個過程中,精原細(xì)胞經(jīng)歷了許多復(fù)雜而精密協(xié)調(diào)的分子事件及細(xì)胞事件,通過增殖和分化形成功能特異的雄性配子--精子。睪丸組織在精子發(fā)生過程中乃至哺乳動物個體形成過程中顯示了很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性,轉(zhuǎn)錄因子在特殊的細(xì)胞事件中調(diào)控基因的表達(dá)。Fank1基因就是一個睪丸特異表達(dá)基因,編碼一種核蛋白,在精子發(fā)生過程的減數(shù)分裂到單倍體階段廣泛表達(dá)

2、,相關(guān)實驗表明該蛋白為睪丸組織特異轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過構(gòu)建GST-FANK1融合表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)FANK1蛋白,并用靶序列循環(huán)擴(kuò)增(CAST)實驗確定FANK1的DNA結(jié)合序列,為進(jìn)一步研究FANK1調(diào)節(jié)的靶基因奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 通過PCR的方法,以pdsRED-Fank1質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增小鼠FANK1蛋白中的FnⅢ結(jié)構(gòu)域DNA序列,將目的片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-2的GST基因下游,轉(zhuǎn)化E.co

3、li BL21(DE3)細(xì)菌,通過內(nèi)切酶鑒定及DNA測序篩選出正確的重組質(zhì)粒。采用不同溫度,0.5mM IPTG對菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分別于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h收集菌體,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析找到最適宜誘導(dǎo)溫度和時間,并且用不同濃度的IPTG(終濃度為0.5mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)濃度。按優(yōu)化條件誘導(dǎo)重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)裂解、透析復(fù)性得到溶解蛋白,該蛋白經(jīng)過GST Bi

4、nd Resin親和層析,獲取純化的GST-FANK1融合蛋白并通過Western Blot鑒定。獲得FANK1蛋白用于CAST實驗,通過對測序結(jié)果的比對來確定蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合序列。
　　 結(jié)果
　　 1、Fank1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后,與原核表達(dá)載體pGEX-4T-2連接,經(jīng)電泳、酶切及DNA測序鑒定表明目的基因成功插入到載體中。
　　 2、鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)30℃,0.5mM IPTG誘導(dǎo)5h表達(dá)

5、量最高,表達(dá)的GST-FANK1融合蛋白分子量約為43kDa。
　　 3、FANK1蛋白以包涵體形式存在,通過裂解包涵體,經(jīng)透析復(fù)性,GST BindResin親和層析,純化得到GST-FANK1融合蛋白。
　　 4、CAST 實驗通過測序獲得的44個結(jié)果比對,DNA序列AAAAAG出現(xiàn)百分率最高。
　　 結(jié)論
　　 1、成功構(gòu)建了小鼠FANK1蛋白FnⅢ結(jié)構(gòu)域的重組原核表達(dá)載體pGEX-FnⅢ。以IPT