小鼠肝癌模型的建立及HPPCn功能初評(píng).pdf

1、本文主要從以下兩個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 肝癌誘發(fā)模型的建立
　　目的:建立HPPCn肝臟特異性過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型和小鼠原發(fā)性肝癌短期誘發(fā)模型。方法:①HPPCn肝臟特異性過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立:利用ApaⅠ、MluⅠ酶將質(zhì)粒pGEM-his-hppcn酶切獲得的重組片段(含有白蛋白增強(qiáng)子、白蛋白啟動(dòng)子、his-hppcn、SV40片段)經(jīng)過(guò)顯微注射進(jìn)入FVB小鼠受精卵原核中,將其植入假孕FVB小鼠的輸卵管中,從

2、10日鼠齡子代小鼠尾中提取基因組,再用精心設(shè)計(jì)的引物Primer3:5’-CAAATGGGAGACAAAGAG-3’,Primer4:5’-AGATGCGTGAGGTTCG-3’對(duì)新生子代小鼠進(jìn)行PCR鑒定。②建立小鼠原發(fā)性肝癌短期誘發(fā)模型:將C57BL/6♀,C57BL/6♂,C3H/Hen♂三種小鼠用腹腔注射的方式給大劑量的二乙基亞硝胺(DEN:C57BL/6♀,300mg/kg;C57BL/6♂,300mg/kg;C3H/Hen♂

3、,200mg/kg)作為肝癌誘發(fā)啟動(dòng)劑,一周后再連續(xù)給3日二乙?；?2-AAF:20mg/kg),然后將小鼠肝臟左葉從根部結(jié)扎并切除(34％肝臟切除),再連續(xù)3日2-AAF灌胃,3周后處死小鼠,把小鼠肝臟一部分提取蛋白和RNA,一部分用福爾馬林固定,48h后送做切片,用放射免疫分析、免疫組化、免疫印跡、Q-PCR等方法對(duì)建模情況予以評(píng)價(jià)。結(jié)果:①經(jīng)過(guò)多次的顯微注射,多次反復(fù)PCR鑒定,獲得三只不同批次的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。②在用DEN進(jìn)行

4、肝癌誘發(fā)時(shí),三種小鼠的給藥劑量及存活率如下:C57BL/6♀,300mg/kg,64.7%;C57BL/6♂,300mg/kg,0;C3H/Hen♂,200mg/kg,41.2%。對(duì)存活的各組小鼠經(jīng)過(guò)多種方法鑒定,發(fā)現(xiàn)同期建模的C57BL/6♀小鼠的各項(xiàng)肝癌相關(guān)參數(shù)均有明顯變化,提示肝癌誘發(fā)成功。結(jié)論:①成功的建立HPPCn肝臟特異性過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。②成功建立了小鼠原發(fā)性肝癌短期誘導(dǎo)模型。
　　第二部分 肝癌移植模型的建立及

5、HPPCn功能初評(píng)
　　目的:建立裸鼠皮下移植瘤模型和肝癌原位移植模型,并且驗(yàn)證HPPCn在肝癌發(fā)展中的作用。方法:①皮下移植瘤模型的建立:首先,采用G418篩選的方法建立了穩(wěn)定干涉HPPCn的HepG2細(xì)胞系,用MTT、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPPCn干涉對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響。然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、HepG2-siNC、HepG2-siHPPCn細(xì)胞,按照2-4×106個(gè)/100μl/只,注射到裸鼠前肢腋下

6、,30日后處死小鼠,將瘤、肝、肺用4%多聚甲醛固定以進(jìn)行病理分析。②小鼠原位移植模型的建立:將對(duì)數(shù)生期HepG2細(xì)胞用無(wú)菌的PBS稀釋至2-4×106個(gè)/100μl/只,對(duì)裸鼠進(jìn)行前肢腋下注射,建立荷瘤小鼠模型,20日后,處死小鼠,無(wú)菌取瘤,去除壞死組織和非瘤組織后剪成4-6mm3的瘤塊盡快植入到健康裸鼠的左葉肝臟中,第30日處死小鼠,取肝臟,肺及肝內(nèi)腫瘤用4%多聚甲醛固定,做病理分析。結(jié)果:①M(fèi)TT,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干涉