慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立及鑒定.pdf

1、移植物抗宿主病(GVHD)是發(fā)病率和病死率均高的異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)后并發(fā)癥。
　　慢性移植物抗宿主病(cGVHD)為allo-HSCT后的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，有著發(fā)生率高、生存率低、嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量等特點(diǎn)。cGVHD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制尚未被充分了解，因此建立cGVHD動物模型以深入探索cGVHD顯得很有必要。
　　目前國際上最常用的cGVHD動物模型為小鼠模型。根據(jù)模型表現(xiàn)和構(gòu)建方法的差異，可以將模型分為四類

2、:硬皮病樣cGVHD小鼠模型，狼瘡樣cGVHD小鼠模型，狼瘡-硬皮病樣cGVHD小鼠模型和胸腺功能缺陷導(dǎo)致的cGVHD小鼠模型。這幾種模型并不是互相獨(dú)立的，但也各有特點(diǎn)。本文所擬建立的硬皮病樣cGVHD小鼠模型應(yīng)用廣泛，其特點(diǎn)為以類似于人類硬皮病的皮膚纖維化為特征，可累及肝、肺、唾液腺等器官，而以這類表現(xiàn)為主的cGVHD可出現(xiàn)在多達(dá)10％-15％的患者中。此模型的分子病理學(xué)基礎(chǔ)為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相合而有眾多的次要組織相容性

3、抗原(miHA)不合。建立本模型的受鼠多需要接受致死劑量的全身放射(TBI)，國外的范例之一為以B10.D2.為供鼠，以BALB/c為受鼠。
　　T細(xì)胞被認(rèn)為參與了cGVHD的形成和加重的全程。如果單純輸注供鼠的骨髓細(xì)胞(BMC)（幾乎不含T細(xì)胞）給受鼠，則不能發(fā)生cGVHD。因此，在建立cGVHD模型的過程中，一般會將供鼠來源的骨髓細(xì)胞與含有較高比例T細(xì)胞的脾細(xì)胞(SpC)混合后一起回輸給受鼠，從而誘發(fā)受鼠的cGVHD。改變脾細(xì)

4、胞輸注量可能會影響移植物中T細(xì)胞的比例，從而影響cGVHD進(jìn)程。而骨髓細(xì)胞中含有的間充質(zhì)干細(xì)胞和髓源抑制細(xì)胞等免疫抑制性細(xì)胞被逐漸發(fā)現(xiàn)，提示了骨髓輸注可能會對cGVHD的進(jìn)程有免疫抑制的效果。盡管有較多的構(gòu)建cGVHD小鼠模型的方案，但在構(gòu)建小鼠cGVHD模型中，還沒有關(guān)于改動骨髓與脾細(xì)胞輸注比例是否會對移植成功率和模型穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的研究。
　　CD4+T細(xì)胞中有功能相異的兩大亞群—Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。一些研究認(rèn)為，Th1細(xì)

5、胞主導(dǎo)了急性移植物抗宿主?。╝GVHD），并且可能因分泌IFN-gamma、 IL-2、IL-12等而誘發(fā)了細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而激活Th2細(xì)胞，通過IL-4、IL-5、IL-10等的作用，導(dǎo)致cGVHD的發(fā)生。研究表明Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子通常在cGVHD時期表達(dá)較低，而同時Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子卻在cGVHD進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，并有可能因此抑制了Th1、Th17等細(xì)胞的增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，因?yàn)門h1和Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞

6、因子之間通常呈拮抗作用。同時，IL-4、IL-5、IL-13等部分Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子被證明能夠刺激纖維母細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原沉積，這些特性被證明與硬皮病樣cGVHD小鼠模型的特征性纖維化有著直接的關(guān)系。盡管Th1細(xì)胞主導(dǎo)的GVHD也能有同樣甚至更加猛烈的炎癥反應(yīng)，但是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子并不能使纖維母細(xì)胞增生并促進(jìn)膠原的沉積，說明了上述纖維化表現(xiàn)只是由于受到Th2及其相關(guān)細(xì)胞因子的作用，而與Th1及其細(xì)胞因子無關(guān)。
　　目的

7、:
　　建立一種能良好地模擬人類cGVHD的小鼠cGVHD模型，鑒定這種模型的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)特征。在建立模型的過程中，了解骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞輸注量的改變對建模成功率和模型建成后較長時間內(nèi)cGVHD嚴(yán)重程度和穩(wěn)定性的影響，進(jìn)而摸索得出建立這個小鼠cGVHD模型的理想骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞輸注量。
　　模型的建立過程中，本文將探索模型隨時間進(jìn)程而改變的病理學(xué)表現(xiàn)和Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子變化情況，鑒定本模型發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制，探討其在模

8、擬人類cGVHD過程中的意義。
　　方法:
　　1.將8-10周齡的雌性BALB/c小鼠(H-2d)隨機(jī)分為以下幾組作為受鼠，每組的脾細(xì)胞輸注量和骨髓細(xì)胞輸注量均有所不同:
　　a)A組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=8∶9＜1）:TBI后尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106，脾細(xì)胞9×106(n=20);
　　b)B組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=6∶9＜1）:TBI后尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞6×106，脾細(xì)胞9×106(n=5);
　　c

9、)C組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=8∶8=1）:TBI后尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106，脾細(xì)胞8×106(n=5);
　　d)D組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=6∶8＜1）:TBI后尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞6×106，脾細(xì)胞8×106(n=5);
　　e)E組:TBI后尾靜脈輸注骨髓細(xì)胞8×106(n=5);
　　f)F組:TBI后無任何處理(n=5);
　　g)G組:無任何處理(n=5)。
　　在給受鼠做好移植前腸道準(zhǔn)備（紅霉素2

10、50毫克/升，慶大霉素32萬單位/升，移植前7天開始并維持至移植后14天）的基礎(chǔ)上，取同樣8-10周齡的雄性B10.D2.(Hc1 H-2d H2-T18c)小鼠作為供鼠，獲取供鼠的BMC和SpC并根據(jù)上述分組調(diào)整至事宜濃度，在受鼠接受完源皮距為100 cm，30 cm×30 cm照射野，700 cGy，698跳，TBI處理后的4小時，經(jīng)由小鼠尾靜脈回輸給受鼠（F組TBI后不回輸細(xì)胞，G組不處理）。
　　2.每日觀察小鼠，移植后前

11、14天監(jiān)測小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)以判斷植入是否成功，第14天開始按照臨床觀察評分表給小鼠評cGVHD分值并記錄，至少每3天的固定時刻評分一次。
　　3.設(shè)置移植后第15天、第25天、第35天、第45天、第55天、第65天、第75天作為觀察點(diǎn)集中評價cGVHD臨床評分，第75天后處死所有小鼠(A組處死5只)。A組小鼠另外設(shè)置移植后第15天、第25天、第35天、第95天作為觀察點(diǎn)，每個觀察點(diǎn)處死3只小鼠并留取外周血血清，用LUMINEX試劑盒

12、檢測Th細(xì)胞亞群相關(guān)的細(xì)胞因子水平。所有死亡或處死小鼠均留取組織病理標(biāo)本。
　　4.病理標(biāo)本制作HE染色切片，并在鏡下根據(jù)cGVHD的病理評分標(biāo)準(zhǔn)評價cGVHD評分，超過2分才能視為發(fā)生了cGVHD。
　　5.分析不同組的臨床cGVHD評分和cGVHD病理改變;分析不同觀察時間點(diǎn)的cGVHD病理改變和細(xì)胞因子水平變化。
　　結(jié)果:
　　1.移植后第8天，所有存活小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)皆大于1×109/L，A、C、E、G

13、組小鼠存活100％，B、D組小鼠存活80％，F(xiàn)組全部死亡，死亡小鼠的死因是造血功能衰竭。第75天的A、B、C、D組的病理學(xué)結(jié)果表明這幾組中的所有小鼠（除前14天死亡的小鼠以外）均有cGVHD。A、C組小鼠的移植成功率優(yōu)于B組和D組(P＜0.05)。
　　2.A組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=8∶9＜1）、B組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=6∶9＜1）、D組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=6∶8＜1）小鼠的cGVHD評分較高而穩(wěn)定，C組（骨髓細(xì)胞∶脾細(xì)胞=8∶8=

14、1）小鼠的cGVHD評分從移植后第50天開始逐漸降低，即不能維持較強(qiáng)的cGVHD臨床表現(xiàn)。其評分在移植后第55天、第65天和第75天較其他組低(P＜0.05)，在移植后第25天和第35天較A組低(P＜0.05)。C組的病理學(xué)改變較其他組輕(P＜0.05)，尤其是皮膚的表現(xiàn)較為明顯。
　　3.本模型的臨床表現(xiàn)以體重減輕，消瘦，脫毛，尾爪部腫脹、硬化、脫皮、結(jié)痂和潰瘍，排稀便，氣促和弓背等為主。A組小鼠移植后第15天的病理學(xué)改變中皮膚

15、以炎性細(xì)胞浸潤為主，肺部有少許炎癥細(xì)胞浸潤;移植后第25天表現(xiàn)為皮膚以脂肪減少和炎性細(xì)胞浸潤為主，肺部結(jié)構(gòu)完好而炎癥細(xì)胞浸潤增加;移植后第35天表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)膠原纖維增生，伴有脂肪層萎縮和炎性細(xì)胞浸潤，肺部表現(xiàn)為基本肺結(jié)構(gòu)遭破壞，伴肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤;移植后第95天表現(xiàn)為皮膚膠原纖維增生明顯，毛囊大幅減少伴炎癥細(xì)胞浸潤，肺部基本肺結(jié)構(gòu)大片消失伴肺間質(zhì)纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤。第95天的cGVHD病理評分高于第15天、第25天、第35天時

16、的cGVHD病理評分(P＜0.05)。
　　4.IFN-gamma(P＜0.05)、IL-1beta(P＜0.05)、IL-2、IL-17A等Th1、Th17相關(guān)的細(xì)胞因子在第15天后含量下降，GM-CSF、IL-12p70等Th1、Th17相關(guān)的細(xì)胞因子在cGVHD進(jìn)程中變化不明顯。而IL-4、IL-5(P＜0.05)等Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子隨cGVHD進(jìn)展而含量升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功建立了小

17、鼠cGVHD模型B10.D2.(Hc1 H-2d H2-T18c)→BALB/c(H-2d)。本模型以纖維化所致的表現(xiàn)為主，主要累及皮膚和肺，也累及消化道等器官。模型在移植后第8天恢復(fù)造血，cGVHD進(jìn)程中靶器官受損由早期的炎癥細(xì)胞浸潤為主向膠原沉積為主轉(zhuǎn)變。
　　本模型cGVHD嚴(yán)重程度與骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞的比例有關(guān)，當(dāng)骨髓細(xì)胞:脾細(xì)胞的比例小于1時，可以獲得穩(wěn)定、持續(xù)且較嚴(yán)重的cGVHD小鼠模型。而當(dāng)骨髓細(xì)胞:脾細(xì)胞=1時，所得