急性移植物抗宿主病宿主中供者來(lái)源造血干祖細(xì)胞的功能研究.pdf

1、研究目的:
　　 造血干細(xì)胞(HSC)是所有成熟血細(xì)胞的來(lái)源。異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是目前血液系統(tǒng)惡性疾病最主要的治療手段之一。但移植過(guò)程中及移植后的并發(fā)癥是影響患者生活質(zhì)量甚至導(dǎo)致患者死亡的重要因素，其中急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-hostdisease，aGVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植后主要的并發(fā)癥之一。重度aGVHD病人多出現(xiàn)一系、兩系甚至全血細(xì)胞減少，對(duì)刺激因子反應(yīng)欠佳，

2、治療上依賴成分輸血，帶來(lái)一系列經(jīng)濟(jì)及療效方面的問(wèn)題。有研究證實(shí)aGVHD是造血功能低下的主要危險(xiǎn)因素，而aGVHD患者出現(xiàn)血小板減少是預(yù)后差的因素之一。但是，就骨髓移植的受者而言，造血系統(tǒng)來(lái)源于供者，因此被認(rèn)為并不是aGVHD的主要攻擊靶點(diǎn)。
　　 本課題以半相合小鼠aGVHD為模型，研究aGVHD宿主體內(nèi)供者來(lái)源正常造血干/祖細(xì)胞(HSC/HPC)數(shù)量和分化過(guò)程障礙；進(jìn)一步分離aGVHD環(huán)境中的正常造血細(xì)胞，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植

3、(cBMT)評(píng)估aGVHD環(huán)境對(duì)供者來(lái)源的正常HSC造血重建能力的影響。課題還在HSC/HPC水平闡明aGVHD環(huán)境中正常造血組織細(xì)胞(尤其是紅系、巨核系)減少的分子機(jī)制，為臨床治療提供線索。
　　 材料和方法:
　　 小鼠骨髓移植受體小鼠：雌性CB6F1小鼠[白細(xì)胞抗原表型(以下簡(jiǎn)稱表型)：CD45.21，為雌性C57BL/6J與雄性BALB/C的F1代。供體小鼠：骨髓細(xì)胞供體B6.SJL-PtprcaPepcb/Bo

4、yJ(B6.SJL，表型CD45.1)。半相合小鼠aGVHD骨髓移植模型CB6F1受體小鼠移植前均接受8Gy一次照射，隨機(jī)分為兩組。aGVHD組每只受體小鼠移植B6。SJL小鼠的骨髓有核細(xì)胞(bonemarrownucleatedcells，BMNC)5×106(CD45.1+)和C57BL/6J小鼠的脾細(xì)胞6×107。對(duì)照組小鼠僅移植相同數(shù)量B6.SJL小鼠的BMNC(CD45.1+)。移植后檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血、骨髓中供者來(lái)源造

5、血細(xì)胞(CD45.1+)的頻率。HSC/HPC的數(shù)量和頻率以Flk2-CD34-Lin-c-Kit+Sca-1+(Flk2-CD34-LKS)為具有長(zhǎng)期造血重建能力的HSC(LT-HSC)的表型，F(xiàn)lk2-CD34+LKS和Flk2+CD34+LKS分別為短期造血重建造血干細(xì)胞(ST-HSC)和多能造血祖細(xì)胞(MPP)的表型：Lin-c-Kit+Sca-1+(LKS)包括LT-HSC、ST-HSC和MPP，代表廣義的小鼠HSC表型。以C

6、D34+CD16/32loLin-c-Kit+Sca-1-(CD34+CD16/32loLKS-)為髓系定向祖細(xì)胞(CMP)的表型，CD34+CD16/32hiLKS-和CD34-CD16/32loLKS-分別為粒單系定向祖細(xì)胞(GMP)和巨紅系定向祖細(xì)胞(MEP)的表型。Lin-c-Kit+Sca-1-(LKS-)包括CMP、GMP和MEP，代表廣義的小鼠HPC表型。移植后不同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)aGVHD組與對(duì)照組小鼠體內(nèi)HSC

7、和HPC的數(shù)量和頻率。集落形成單位(CFU)檢測(cè)移植后2周分選aGVHD組和對(duì)照組供者來(lái)源造血細(xì)胞(CD45.1+)進(jìn)行CFU檢測(cè)，10天后顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)，每組4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞周期分析移植后1周、2周、3周，用RNA染料Ki67和DNA染料Hoechst33342盒結(jié)合HSC/HPC細(xì)胞表面標(biāo)記(Lin-Scal+CD150+)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組HSC/HPC的細(xì)胞周期水平(G0期/G1期/(G2+S/M)期)。細(xì)胞凋亡分析移植后1

8、周、2周、3周，用AnnexinV-PE試劑盒結(jié)合HSC/HPC細(xì)胞標(biāo)記(Lin-Scal+CD150+)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組HSC/HPC的凋亡水平?；虮磉_(dá)檢測(cè)移植后2周，流式細(xì)胞術(shù)分別分選aGVHD組和對(duì)照組的LKS、Flk2-CD34-LKS(LT-HSC)并DCD34+CD16/32loLKS-(CMP)細(xì)胞群，并以RLT+β-巰基乙醇重懸。采用RNeasyMiniKit試劑盒提取RNA，兩步法從細(xì)胞直接制備cDNA。以GAP

9、DH為參照基因，用Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)GATA-1、GATA-2、c-mpl和FOXO3a等紅系、巨核系生成相關(guān)調(diào)節(jié)基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)aGVHD組和對(duì)照組不同基因的Ct值，計(jì)算不同造血微環(huán)境中，不同基因在各細(xì)胞群的相對(duì)表達(dá)量。環(huán)孢素(CsA)干預(yù)移植后第0天起腹腔注射的形式給予CsA10mg/Kg/d，直至觀察期(30天)結(jié)束。同時(shí)監(jiān)測(cè)生存、體重、造血各系比例及分化情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料比較采用Studenttt

10、est，計(jì)數(shù)資料比較采用x2test。生存資料采用Prism5.0軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立半相合小鼠aGVHD模型，aGVHD發(fā)病率為100％。aGVHD組小鼠移植10天后逐漸出現(xiàn)弓背、脫毛、腹瀉、體重減輕等典型的aGVHD癥狀，中位生存時(shí)間是19.5天(15-23天)。對(duì)照組在30天觀察期內(nèi)全部存活。aGVHD發(fā)病率為100％。aGVHD組小鼠與對(duì)照組相比呈現(xiàn)外周血三系急劇減少。移植后+2w，aGV

11、HD組小鼠全髓細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的43％[(1.51±0.10)×108vs(0.66±0.10)×108，P<0.05]，aGVHD組供者來(lái)源造血細(xì)胞(CD45.1)的植入率顯著低于對(duì)照組[(57.78±2.05)％vs(98.23±0。82)％，P<0.05]。
　　 2.aGVHD環(huán)境中HSC/HPC數(shù)量顯著低于對(duì)照組而頻率顯著高于對(duì)照組移植后2周，aGVHD組骨髓HSC/HPC數(shù)量低于對(duì)照組，在HPC表型細(xì)胞群中尤為明顯。但

12、在供者來(lái)源細(xì)胞中的頻率顯著高于對(duì)照組，在HSC表型細(xì)胞群中尤為明顯。
　　 3.aGVHD宿主中成熟細(xì)胞中B細(xì)胞頻率顯著低于對(duì)照組移植后每三天檢測(cè)外周血各系的細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，aGVHD組小鼠外周血各系細(xì)胞減少，尤其在B細(xì)胞系中更為明顯。移植+12天后，aGVHD組小鼠B細(xì)胞在外周血供者來(lái)源細(xì)胞中的頻率顯著低于對(duì)照組；而成熟T細(xì)胞及成熟B細(xì)胞在外周血供者來(lái)源細(xì)胞中的頻率，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差別；成熟單核細(xì)胞在外周血供者來(lái)源細(xì)胞中的頻

13、率則高于對(duì)照組。
　　 4.aGVHD環(huán)境中供者來(lái)源造血細(xì)胞CFU形成能力顯著高于對(duì)照組移植后第2周，aGVHD組供者來(lái)源造血細(xì)胞集落形成能力均不同程度地高于對(duì)照組。CFU-E[(4。25±0.63)vs(1.0±0.42)，P=0.005]、BFU-E[(0.75±0.48)vs(0.5±0.29)，P=0.67]、CFU-G[(8.25±0.48)vs(1.25±0.25)，P=0.000]、CFU-M[(4.25±0.86

14、)vs(1.5±0.29)，p=0.022]、CFU-GM[(3.25±0.85)vs(1.25±0.25)，P=0.066]、CFU-Mix[(7.50±1.85)vs(2.25±0.75)，P=0.039]，aGVHD組CFU總數(shù)約為對(duì)照組的4倍[(28.25±2.28)vs(7.75±0。75)，P=0.000]。
　　 5.aGVHD宿主中供者來(lái)源造血細(xì)胞歸巢未受影響移植后16小時(shí)，檢測(cè)aGVHD組與對(duì)照組骨髓中供者來(lái)源

15、細(xì)胞比例(CD45.1+％)來(lái)表示歸巢效率，兩組小鼠無(wú)顯著差異。
　　 6.aGVHD宿主中HSC/HPC更為靜息移植后+7d，aGVHD組小鼠HSC細(xì)胞周期中G0期比例高于對(duì)照組，分別為(42.86±1.77)％和(35.32±1.23)％(P=0.01)；而(G2+S/M)期比例低于對(duì)照組，分別為(32.81±1.13)％和(43.94±2.36)％(P=0.001)。
　　 7.aGVHD環(huán)境對(duì)供者來(lái)源造血細(xì)胞的壽

16、命無(wú)顯著影響移植后+2w，aGVHD環(huán)境中全BM、HPC、MPP、HSC凋亡情況檢測(cè)均顯示與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果說(shuō)明，aGVHD的發(fā)生并不直接增加HSC/HPC凋亡比例，在aGVHD環(huán)境中造血干祖細(xì)胞的減少，并不由于其生存時(shí)間縮短引起。
　　 8.aGVHD宿主中造血祖細(xì)胞階段存在分化阻滯移植后2周，aGVHD組骨髓CMP/GMP/MEP數(shù)量顯著低于對(duì)照組，其中CMP/MEP占CD45.1+細(xì)胞頻率顯著低于對(duì)照組，而GMP占

17、CD45.1+細(xì)胞頻率顯著高于對(duì)照組。與此同時(shí)比較LT-HSC/ST-HSC/MPP占LKS比例，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而CMP/GMP/MEP占LKS-細(xì)胞比例上，兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在CMP到MEP階段存在分化阻滯。
　　 9.轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)證明，aGVHD環(huán)境中紅系、巨核系分化障礙主要由于CMP向MEP分化障礙所致aGVHD環(huán)境中CMP細(xì)胞群紅系、巨核系相應(yīng)正性調(diào)控基因GATA-1、GATA-2、c-mpl、FO

18、G、RUNX1等表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而負(fù)性調(diào)控基因FOXO3a表達(dá)顯著高于對(duì)照組。而在LT-HSC/LKS階段無(wú)相應(yīng)改變。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，在aGVHD環(huán)境中，紅系、巨核系的分化障礙主要是由于CMP向MEP分化受阻所致。
　　 10.CsA能改善aGVHD宿主中造血分化異常在構(gòu)建aGVHD模型的同時(shí)，從第0天開(kāi)始CsA干預(yù)組腹腔注射的形式給予每天10mg/KgCsA，發(fā)現(xiàn)在生存情況和體重減輕方面優(yōu)于aGVHD組，全髓細(xì)胞數(shù)及BMCD

19、45.1+％方面得到一定程度的提高，并且在CMP/GMP/MEP的分化階段CsA能有效控制aGVHD環(huán)境所致的分化障礙。
　　 結(jié)論:
　　 1.首次證明在aGVHD環(huán)境中，供者來(lái)源HSC/HPC數(shù)量顯著低于對(duì)照組，但HSC/HPC占供者來(lái)源CD45.1+細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，且體外CFU克隆形成能力顯著增強(qiáng)。aGVHD組HSC相對(duì)靜息，HSC/HPC凋亡分析上兩組無(wú)顯著差別。結(jié)果說(shuō)明，aGVHD的發(fā)生主要抑制HSC增

20、殖和向下分化，HPC細(xì)胞池正常向下分化且得不到上游細(xì)胞分化補(bǔ)充因而耗竭，這一效應(yīng)并非由于生存時(shí)間縮短所致。
　　 2.首次證明aGVHD宿主出現(xiàn)的紅系、巨核系急劇減少主要由于CMP向MEP分化障礙所致。CMP、MEP在供者來(lái)源細(xì)胞中比例顯著低于對(duì)照組，而GMP比例顯著高于對(duì)照組；且在LKS-分化階段，CMP/GMP/MEP占LKS-細(xì)胞比例兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CMP轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，GATA-1、G