細胞因子動員的骨髓移植對急性移植物抗宿主病的影響.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定可靠的急性GVHD小鼠模型，對細胞因子G-CSF單用及聯(lián)合甲強龍、環(huán)孢素A動員后所獲得的移植物細胞數(shù)量、細胞亞群、細胞因子的變化進行測定，對供體采取這些措施進行異基因骨髓移植后急性GVHD和移植物抗白血病效應（GVL）的變化與對照組進行比較分析，研究不同來源移植物影響急性GVHD的可能機制，探討在實施HLA半相合移植中對供體采用細胞因子聯(lián)合甲強龍、環(huán)孢素動員的可能性，為預防治療急性GVHD提供新思路.方法：1）選擇C57B

2、L/6小鼠作供體，B6D2F1、BALB/C小鼠分別作為受體建立小鼠骨髓移植急性GVHD模型，每只小鼠接受5×10<'6>個骨髓細胞與2×10<'7>個脾細胞混合后尾靜脈注射.應用綠熒光轉(zhuǎn)基因小鼠作供體建立標記移植物GVHD模型;探討建立小鼠外周血干細胞移植的急性GVHD模型.以移植后35天生存率、體重變化、癥狀體征綜合評分系統(tǒng)及肝臟、小腸和皮膚的組織病理變化半定量評分系統(tǒng)對GVHD進行評價.2）采用細胞因子G-CSF單用、G-CSF+

3、甲強龍、G-CSF+甲強龍+環(huán)孢素A三種不同方案動員供體小鼠，測定外周血白細胞計數(shù)、骨髓細胞得率、脾細胞得率、粒-巨噬細胞集落（CFU-GM）形成率、CD4+/CD8+比率、混合淋巴細胞培養(yǎng)異基因反應性、供體脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1的水平，半定量RT-PCR的測定供體小鼠脾臟細胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1 mRNA水平.3）分別采用經(jīng)過上述處理后的移植物進行異基因骨髓移植后觀察對急性GVHD

4、的影響，從動物生存率、體重變化曲線、臨床表現(xiàn)、病理組織形態(tài)學改變等方面進行了觀察.選擇移植后第14、21、27、35天不同時間點流式細胞儀檢測CD4+/CD8+比率，ELISA測定受體小鼠脾細胞體外培養(yǎng)上清細胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1的水平，半定量RT-PCR的測定受體小鼠脾臟細胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1 mRNA水平.4）應用逆轉(zhuǎn)錄載體pLNG轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細胞白血病系A20細胞，建立了攜帶綠熒光標記的轉(zhuǎn)基因

5、細胞系A20eGFP，體外細胞傳代培養(yǎng)比較它與A20細胞增殖性是否存在差異;分別尾靜脈注射5×10<'6>/只兩種細胞給BALB/c小鼠進行體內(nèi)荷瘤實驗觀察其致瘤性改變.對荷瘤動物進行骨髓移植，供體采用經(jīng)過細胞因子G-CSF及聯(lián)合甲強龍、環(huán)孢素動員的小鼠，觀察移植后生存時間，與對照組比較肝臟、脾臟、外周血白血病細胞比例的變化，以此來評價移植物抗白血病效應的變化.結(jié)論：1）BLAB/C小鼠作為受體建立的致死性急性GVHD模型有可靠的臨床和

6、病理評價指標，這個模型在我們對G-CSF單用及聯(lián)合甲強龍、環(huán)孢素動員的實驗中表現(xiàn)穩(wěn)定可靠.綠熒光轉(zhuǎn)基因小鼠GVHD模型的病理學評價指標可靠并且便于檢測.H-2不合小鼠間外周血移植GVHD模型移植發(fā)生移植排斥率高，急性GVHD表現(xiàn)不明顯.2）細胞因子G-CSF動員后獲得的細胞數(shù)量增加、造血干/祖細胞增加，CD4/CD8比率下降、混合淋巴細胞異基因反應性降低;聯(lián)合應用甲強龍、環(huán)孢素動員不改變造血干/祖細胞數(shù)量、CD4/CD8比率、CFU-G

7、M集落形成能力，但使混合淋巴細胞反應性降低.細胞因子IL-4、TGF-β1分泌水平增高，IFN-γ的分泌水平降低.3）G-CSF單用及聯(lián)合免疫抑制劑動員后異基因骨髓移植可以促進供體型完全植入，可以減輕小鼠急性GVHD的臨床表現(xiàn)和組織病理學改變，其中以G-CSF聯(lián)合甲強龍動員效果最好，G-CSF單用及G-CSF+MP+CsA組效果無差異，機制可能與CD4/CD8比率降低、脾細胞表達IFN-γ減低、IL-4、TGF-β1增高相關.4）荷瘤動