NK細(xì)胞重建與急性移植物抗宿主病相關(guān)性研究.pdf

1、隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneichematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）后患者治愈率得到極大的提高。但由于缺乏有效預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療措施，急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease， aGVHD），特別是激素耐藥的aGVHD，仍是制約allo-HSCT治愈率的關(guān)鍵技術(shù)性瓶頸[1]。aGVHD對(duì)靶細(xì)胞的損害可分

2、為三步：
　?、僦委熛嚓P(guān)的損傷導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的大量釋放，從而啟動(dòng)aGVHD；
　?、赥細(xì)胞激活后開(kāi)始增殖活化；
　?、跿細(xì)胞攻擊患者上皮組織或器官。故aGVHD治療的關(guān)鍵在于抑制T細(xì)胞的增殖活化，但這也帶來(lái)了腫瘤復(fù)發(fā)和重癥感染的風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。自然殺傷（Natural killer，NK）細(xì)胞可快速殺傷患者體內(nèi)變異的細(xì)胞，具有抗腫瘤和抗感染的作用，對(duì)allo-HSCT具有重要意義。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞在抗腫瘤、抗

3、感染的同時(shí)，還具有抗aGVHD和促進(jìn)移植物植入的作用[4]，為防治aGVHD帶來(lái)了新的希望。
　　NK細(xì)胞在allo-HSCT后快速實(shí)現(xiàn)數(shù)量重建[5,6]，此時(shí)NK細(xì)胞抗aGVHD作用是靠殺傷抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells,APCs），阻斷T細(xì)胞的活化而得以實(shí)現(xiàn)[7]。NK細(xì)胞同時(shí)表達(dá)抑制性和活化性受體，其對(duì)APCs的殺傷活性是由兩種受體與配體的結(jié)合情況共同決定的。當(dāng)APCs表面抑制性配體表達(dá)缺失，

4、或活化性配體表達(dá)高于抑制性配體時(shí)，NK細(xì)胞將被激活，特異性的殺傷APCs。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，allo-HSCT后免疫重建的NK細(xì)胞表面的受體譜表達(dá)改變，特別是抑制性受體表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致免疫重建的NK細(xì)胞功能受到抑制，殺傷靶細(xì)胞的活性低下。NK細(xì)胞功能抑制這一情況將持續(xù)到allo-HSCT后半年左右[8,9]。免疫重建的NK細(xì)胞作為一種功能被抑制的免疫細(xì)胞，是否還能殺傷APCs，是否還能有效發(fā)揮抗aGVHD作用，目前尚未明確。本研究通過(guò)分析

5、NK細(xì)胞的重建情況，探討NK細(xì)胞重建與aGVHD的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究重建NK細(xì)胞的抗aGVHD作用奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究首先觀(guān)察了患者allo-HSCT后NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性與正常人的差異，分析了allo-HSCT后NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性恢復(fù)情況，從而綜合評(píng)價(jià)NK細(xì)胞的重建。實(shí)驗(yàn)思路簡(jiǎn)述如下：選取2015年1月至2015年7月，在本院行allo-HSCT的26例患者，其中男性17例，女性9例，患者中位年齡37（12～62）歲。采集患

6、者allo-HSCT后+30d、+60d、+90d時(shí)外周血作為實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)流式細(xì)胞儀（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)外周血中NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性。將供者作為對(duì)照組，界定 NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性的正常值。將外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分離出外周血后計(jì)數(shù)。用CD45-APC、CD56-FITC、CD16-FITC和CD3-PerCP標(biāo)記PBMCs，F(xiàn)CM檢測(cè)出PBM

7、Ns中CD45、CD3、CD56、CD16的表達(dá)情況，計(jì)算CD3-CD56+CD16+的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)。用CSFE熒光標(biāo)記K562細(xì)胞。將K562細(xì)胞單獨(dú)孵育作為對(duì)照組，觀(guān)察K562細(xì)胞自然凋亡率。將NK細(xì)胞與K562細(xì)胞按1:1比例共同培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，觀(guān)察NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷活性。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育2.5小時(shí)后用碘化丙啶（propidium Iodide，PI）標(biāo)記，F(xiàn)CM檢測(cè)CSFE+PI+的細(xì)胞（即凋亡的K562

8、），最后計(jì)算出NK細(xì)胞殺傷活性。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性的檢測(cè)結(jié)果，探索allo-HSCT后NK細(xì)胞數(shù)量和功能的重建情況。研究結(jié)果顯示：正常人NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性為（1198±514）個(gè)/μl和（14.0±6.8）％?；颊遖llo-HSCT后+30d、+60d、+90d時(shí)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（951±403）個(gè)/μl、（1358±418）個(gè)/μl和（1255±353）個(gè)/μl，與正常人無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；颊逳K細(xì)胞活性分別為（7.3±3

9、.7）%、（9.4±3.6）%和（9.3±2.4）%，較正常人顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明，allo-HSCT后+30d時(shí)，NK細(xì)胞計(jì)數(shù)能恢復(fù)到正常人水平。但allo-HSCT后+90d內(nèi)，NK細(xì)胞活性低下。NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性在allo-HSCT后+30d時(shí)較+60d、+90d時(shí)低下。Allo-HSCT后NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性的降低是否會(huì)影響其抗aGVHD作用，從而增加aGVHD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)則有待于進(jìn)一步研究。
　　因此，本研究第二部分對(duì)26

10、例患者進(jìn)行了跟蹤隨訪(fǎng)，以探索NK細(xì)胞重建對(duì)aGVHD發(fā)病的影響。實(shí)驗(yàn)思路簡(jiǎn)述如下：根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和相關(guān)病理指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)26例患者aGVHD發(fā)病、總體生存（overall survival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存（progression-freesurvival，PFS）等臨床資料，分析NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性與aGVHD發(fā)病和預(yù)后的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示：根據(jù)患者是否發(fā)生aGVHD，將26例患者分為aGVHD組（11例）和無(wú)aGVHD組（15例）

11、。與無(wú)aGVHD組相比，aGVHD組患者在allo-HSCT后+30d時(shí)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性顯著降低，即（655±216）個(gè)/μl vs（1169±372）個(gè)/μl（p=0.002）和（7.3±3.6）%vs（9.0±3.6）%（p=0.008）。根據(jù)患者是否發(fā)生Ⅱ～Ⅳ度aGVHD，進(jìn)一步將26例患者分為Ⅱ～Ⅳ度aGVHD組（7例）和0～Ⅰ度aGVHD組（19例）。與0～Ⅰ度aGVHD組相比，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD組患者NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性同樣

12、顯著降低，且差異更為顯著，即（617±220）個(gè)/μl vs（1081±399）個(gè)/μl（p=0.001）和（4.2±1.7）%vs（8.3±3.5）%（p=0.001）。NK細(xì)胞計(jì)數(shù)（γ=—0.628，p=0.001）及活性（γ=—0.535，p=0.005）與aGVHD發(fā)病呈中度負(fù)相關(guān)。生存結(jié)果顯示，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD組復(fù)發(fā)率顯著升高（57%vs5%，p=0.010），且1年P(guān)FS率明顯下降（43%vs84%，p=0.010）。Ⅱ～

13、Ⅳ度aGVHD組患者的1年OS率同樣低于0～Ⅰ度aGVHD組（71%vs90%），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.374）。以上結(jié)果說(shuō)明，allo-HSCT后發(fā)生aGVHD的患者+30d時(shí)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性較未發(fā)生aGVHD的患者顯著降低，且發(fā)生Ⅱ～Ⅳ度aGVHD患者的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性降低更為顯著。Allo-HSCT后+30d時(shí)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性與aGVHD呈中度負(fù)相關(guān)性。+30d時(shí)NK細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性低下的aGVHD患者，其復(fù)發(fā)率顯著高，PF