人源化肝臟嵌合體小鼠模型的建立及MSC介導(dǎo)的免疫抑制作用在肝細(xì)胞移植中的應(yīng)用.pdf

1、應(yīng)用人肝細(xì)胞異種移植到受體小鼠肝內(nèi)建立人源化肝臟的嵌合體小鼠（人鼠嵌合肝），對(duì)藥物代謝、乙型肝炎病毒等嗜肝性病毒及其疫苗的研究具有重要意義。延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除小鼠（Fah-/-小鼠），是模擬遺傳型酪氨酸血癥Ⅰ型疾病建立的小鼠模型。作為國(guó)際上公認(rèn)度很高的肝損傷模型之一，F(xiàn)ah-/-小鼠已被廣泛應(yīng)用于肝臟再殖的研究。Fah-/-小鼠是開展肝細(xì)胞移植的理想模型，100個(gè)移植的肝細(xì)胞就能重建Fa-/-小鼠肝臟5％的細(xì)胞（約2×105

2、個(gè)細(xì)胞），并可重建肝小葉的結(jié)構(gòu)與功能。非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠具有T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷、NK細(xì)胞活性低下、無循環(huán)補(bǔ)體、無巨噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞功能損害等多種先天和獲得性免疫缺陷，不易發(fā)生免疫逃逸，是理想的異種移植模型。本研究結(jié)合Fah-/-小鼠的肝臟再殖優(yōu)勢(shì)和Nod/Scid小鼠可以異種移植的特點(diǎn)，將兩個(gè)小鼠品系進(jìn)行雜交繁育建立Fah-/-Nod/Scid小鼠品系，開展人肝細(xì)胞移植Fah-/-Nod/

3、Scid小鼠建立人源化肝臟嵌合體小鼠模型的研究。通過觀察人肝細(xì)胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及其程度，評(píng)價(jià)再殖的人肝細(xì)胞是否具有正常的肝細(xì)胞功能，評(píng)價(jià)利用人肝細(xì)胞移植Fah-/-Nod/Scid小鼠建立人鼠嵌合肝模型的可行性。
　　 同時(shí)，在臨床上開展肝細(xì)胞移植治療肝臟疾病的實(shí)踐中，應(yīng)用同種異基因人肝細(xì)胞移植時(shí)可能導(dǎo)致的免疫反應(yīng)是不得不考慮的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)能與先天或獲得性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞相互作用，

4、通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子發(fā)揮免疫抑制和組織修復(fù)的作用，為其在臨床上應(yīng)用以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞移植時(shí)的免疫反應(yīng)提供了可能的選擇方案。因此，在第二部分研究中，我們以同種異基因小鼠肝細(xì)胞與MSCs混合移植Fah-/-小鼠模型，以移植細(xì)胞是否再殖受體小鼠肝臟作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察間充質(zhì)干細(xì)胞在肝細(xì)胞移植中是否發(fā)揮免疫抑制作用，以及這種作用是否能促進(jìn)同種異基因小鼠肝細(xì)胞在受體肝臟中的再殖。
　　 在第一部分研究中，首先，通過雜交、基因型鑒定及保種繁育

5、，我們建立了Fah-/-Nod/Scid小鼠品系，該品系可以純合保種并能正常繁殖;其次，我們開展了同種異基因小鼠肝細(xì)胞移植Fah-/-Nod/Scid小鼠的工作。通過觀察小鼠肝細(xì)胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及其程度，評(píng)價(jià)建立的Fah-/-Nod/Scid小鼠是否具備免疫缺陷Fah-/-小鼠的基本生物學(xué)特性，為下一步進(jìn)行人肝細(xì)胞移植建立人鼠嵌合肝模型奠定基礎(chǔ);第三，分離原代人肝細(xì)胞并移植Fah-/-Nod/Scid小鼠

6、。在人肝細(xì)胞移植前后，我們針對(duì)受體小鼠采取了一系列預(yù)處理措施，包括:人肝細(xì)胞移植前一周逐步撤除Fah-/-小鼠抑制藥物NTBC，提前誘導(dǎo)受體小鼠肝臟的損傷以形成外源細(xì)胞植入的微環(huán)境;細(xì)胞移植后以臨床上常用的免疫抑制劑——FK506抑制異種細(xì)胞移植后的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)植入人肝細(xì)胞的增殖。通過以上處理措施，觀察人肝細(xì)胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的再殖及再殖的肝細(xì)胞是否具有正常的肝細(xì)胞功能。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，移植的

7、人肝細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝臟中的顯著增殖，肝臟再殖程度達(dá)到30％以上。采用體重曲線、肝功能和人肝細(xì)胞功能蛋白表達(dá)等三方面指標(biāo)評(píng)價(jià)嵌合肝臟中人肝細(xì)胞的功能，結(jié)果表明再殖的肝細(xì)胞具有正常的人肝細(xì)胞功能。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ah-/-Nod/Scid小鼠可以作為理想的可規(guī)模應(yīng)用的人鼠嵌合肝模型，該技術(shù)體系的改進(jìn)簡(jiǎn)化了Fah-/-小鼠作為人源化肝臟小鼠模型的實(shí)用性問題。
　　 在第二部分研究中，應(yīng)用提前撤除受體小鼠

8、抑制藥物NTBC的預(yù)處理方案，我們分別將未處理及以細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α活化處理的MSCs混合C57BL/6J品系小鼠肝細(xì)胞移植129S4品系的Fah-/-小鼠，同時(shí)選擇在混合移植前1天及移植后1、3、5、7天分別對(duì)受體尾靜脈注射MSCs以增強(qiáng)其免疫抑制作用。采用免疫組織化學(xué)、體重曲線以及肝臟生化指標(biāo)，觀察不同處理的MSCs在同種異基因小鼠肝細(xì)胞移植中的免疫抑制作用。結(jié)果表明，C57BL/6J肝細(xì)胞單獨(dú)移植129S4 Fah-/

9、-小鼠時(shí)，未見任何移植細(xì)胞的植入和增殖;C57BL/6J肝細(xì)胞混合未經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)處理MSCs移植時(shí)，129S4 Fah-/-小鼠肝臟中出現(xiàn)單個(gè)散在的移植細(xì)胞植入;C57BL/6J肝細(xì)胞混合經(jīng)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α活化處理MSCs移植時(shí)，移植細(xì)胞在受體肝臟中的再殖程度提高，損傷的肝臟功能明顯改善。這些結(jié)果初步表明MSCs在同種異基因小鼠肝細(xì)胞移植中發(fā)揮了一定的免疫抑制作用，并改善了受體小鼠的肝臟功能，為進(jìn)一步開展應(yīng)用MSCs調(diào)節(jié)