嵌合狀態(tài)對大鼠肺移植慢性排斥產生免疫抑制作用的實驗研究.pdf

1、肺移植是終末期肺病唯一有效的治療方法。盡管目前肺移植的術后一年生存率可達71％，約46％的患者術后生存期可超過5年，但真正限制肺移植患者長期生存的原因仍然是移植術后的慢性排異，其最終結果即閉塞性細支氣管炎(ObliteransBronchiolitis，OB)的發(fā)生。國外的大宗資料統(tǒng)計表明，在生存期超過3月的病人中，有28％以上的患者存在著不同程度的OB；移植術后第一年OB發(fā)生率為50％。更長期的隨訪資料提示，在肺移植術后5到10年后，

2、OB的發(fā)生率將高達60-80％。它不單可以直接導致死亡，同時也可以通過繼發(fā)感染、以及相關治療所引起的各類不良反應等間接導致患者死亡。匹茲堡醫(yī)學中心的經驗認為近25-40％的患者直接或者間接病死于OB。
　　 目前預防和治療移植后排斥反應的主要手段是應用免疫抑制藥物。這些藥物除需終生服用外，其毒副作用也非常明顯，且價格昂貴，部分患者甚至因藥物的毒副作用或經濟負擔被迫停藥；同時此類免疫抑制治療OB的方法往往療效不理想，嚴重影響移植患

3、者的長期存活。因此，研究免疫抑制或耐受的有效方法，對預防和治療慢性排異的發(fā)生、進一步延長移植物存活具有至關重要的意義。
　　 近年來隨著研究的不斷深入，臨床免疫學家發(fā)現器官移植后通過向受體移植供體造血干細胞或骨髓來源的間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs)建立混合嵌合體，對免疫耐受的誘導有幫助。這一理論的提出解決了困繞移植學者多年的免疫排斥難題，成為目前移植領域研究的新前沿。

4、
　　 BM-MSCs是成體干細胞的一種，存在于骨髓中，具有干細胞的共性和很強的自我增殖能力及多向分化潛能，能表達多種表面抗原和分泌多種細胞因子，是一種較原始的骨髓基質細胞。研究發(fā)現經非清髓處理后，骨髓間充質干細胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BM-MSCs)輸注受體后，髓系樹突狀細胞(DC)會定向遷移至胸腺并向T細胞提供陰性選擇信號，有可能產生外周免疫耐受，這為抑制慢性排異提供了可能。

5、　　 綜上所述，我們構想將骨髓細胞移植用于誘導受體嵌合，并進一步誘導肺移植慢性排異的免疫抑制或免疫耐受，并對肺移植慢性排異的機理進行探討。
　　 1、實驗分兩組：實驗組（I組）采用10只SD大鼠為供體，10只Wistar大鼠為受體；對照組（II組）10只供體、受體均采用SD大鼠。均行異位氣管移植。術后3，14，28天，處死大鼠，取出移植物。鏡下觀察：氣道閉塞情況；氣道上皮完整性；氣道粘膜下炎細胞浸潤、纖維組織增生的情況。

6、>　　 2、實驗分7組(n=10)：A組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次，7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經尾靜脈輸注生理鹽水0.8mL。B組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)—次。7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細胞(BMC)的細胞懸液0.8m

7、l。C組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次。7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)的細胞懸液0.8ml。D組：移植前5天開始給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術前一天受體Wistar大鼠腹腔內注射抗淋巴細胞血清1ml。2天后直接行大鼠

8、氣管異位移植，移植后4h內經尾靜脈輸注生理鹽水0.8mL。移植當天起至術后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。E組：移植前5天開始給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術前一天受體Wistar大鼠腹腔內注射抗淋巴細胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細胞(BMC)的細胞懸液0.8ml。移植當天起至術

9、后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。F組：移植前5天開始給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術前一天受體Wistar大鼠腹腔內注射抗淋巴細胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)的細胞懸液0.8ml。移植當天起至術后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。G組

10、：移植前5天開始給予腹腔內注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術前一天受體Wistar大鼠腹腔內注射抗淋巴細胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細胞(BMC)的細胞懸液0.8ml。移植當天起至術后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。移植后6天經大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質干細胞(B

11、M-MSCs)的細胞懸液0.8ml。隨后測定異基因嵌合體量的變化及單向混合淋巴細胞培養(yǎng)的刺激效應，流式細胞儀檢測了T淋巴細胞亞群的變化，檢測細胞移植后受體內IL-2、IL-IO細胞因子的表達和氣管的阻塞率。檢測移植物病理組織學，并進行統(tǒng)計學分析。
　　 1、兩組移植氣管及支氣管的閉塞性細支氣管炎發(fā)生率實驗組閉塞性細支氣管炎的發(fā)生率為100％，對照組未發(fā)生閉塞。對照組與實驗組移植氣管及支氣管閉塞性細支氣管炎發(fā)生率差異具有顯著性意義

12、
　　 2、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射經環(huán)磷酰胺預處理后行BMC/BM-MSCs移植，E、F組動物接受FK506腹腔注射后行BMC/BM-MSCs移植，在外周血、脾臟中均檢測到嵌合的存在。輸注BMC組較BM-MSCs組嵌合體水平維持更久。A、D組動物未接受BMC/BM-MSCs移植的未檢測到嵌合。但嵌合體模型隨著時間推移，其嵌合會漸漸消失。
　　 3、于氣管移植后21天后取雌性Wistar大鼠脾淋巴細胞作為效

13、應細胞，用雄性SD脾淋巴細胞經絲裂霉素處理后作為刺激細胞將兩者行單向混合細胞培養(yǎng)，A、B、C、D、E、F、G組與O組相比均呈增殖反應。計算刺激效應結果顯示：C組較B組和A組的受體淋巴細胞增殖顯著減弱(P<0.05)；B組較A組也顯著減弱(P<0.05)。G組較D、E、F組的受體淋巴細胞增殖顯著減弱(P<0.05)；F組較E組也顯著減弱(P<0.05)，E、F組較同期B、C組無明顯差異。
　　 4、大鼠接受5Gy全身照射后外周淋巴

14、細胞于照后一周左右降至最低水平，經輻照后白細胞中T細胞亞群CD3+細胞比例急劇減低降至5％左右，但各處理組中CD3+細胞中CD4+、CD8+含量比值并無大的變化，只是與正常大鼠相比CD4+有所降低，而CD8+的含量稍有上升。
　　 5、受體IL-2水平在無處理組（A、D組）氣管移植后28天時較移植前明顯升高(P<0.05)，而在實驗組（B、C、E、F、G組）移植術后IL-2水平較移植前也有升高，與A、D組比較有統(tǒng)計學差異(P<0

15、.05)。無處理組受體IL-10水平在移植后28天時較移植前無明顯差別(P>0.05)，實驗組（B、C、E、F、G組）在移植后28天時明顯升高，與A組、D組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。E、F組較同期B、C組無明顯差異。
　　 6、BMC移植組和BM-MSCs移植組氣管移植后28天阻塞率較對照組減低。移植后28天阻塞率E、F組較同期B、C組減低。
　　 7、A、D組氣管纖毛比例遠低于正常氣管和G組(P<0.01)，G

16、組氣管和正常氣管相比無統(tǒng)計學意義。B組和E組相比無統(tǒng)計學意義，C組和F組相比無統(tǒng)計學意義。
　　 8、于術后28天分批處死動物，在對照組標本中可以觀察到嚴重的結締組織包裹。在低倍鏡下觀察，對照組標本的氣管管腔內有肉芽組織向管腔內增生，造成管腔閉塞。鏡下觀察可見對照組組在術后28天移植氣管內有大量炎性細胞浸潤，上皮層有壞死、脫落，可見有大量肉芽組織向管腔內生長，氣管管腔幾乎完全閉塞。而在使用BMC/BM-MSCs干預下，上述情況有

17、所改善。見管腔通暢，上皮細胞少量壞死、脫落，覆蓋于移植氣管內壁，氣管壁內可見少量炎細胞浸潤。但B、C、E、F、G各組差別不明顯。
　　 1．大鼠氣管異位移植模擬肺移植慢性排斥反應。
　　 2．新型的非破壞骨髓的預處理與傳統(tǒng)的照射等非清髓性預處理方式比較同樣誘導出了嵌合，并且在抑制慢性排斥反應方面同樣有效。
　　 3．通過在非清髓性預處理后輸注供體骨髓細胞或骨髓間充質干細胞，可以建立混合嵌合體，調節(jié)Th1/Th2型