血管抑素的基因?qū)雽?duì)大鼠乳腺移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究.pdf

1、目的：腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都是血管依賴(lài)性的，新生血管的生成不僅為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也為腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移提供了可能。研究表明高血管密度是乳腺癌的高危因子之一，新生血管的形成直接和乳腺癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)，因此，抗腫瘤血管生成已成為近年乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)。血管抑素作為腫瘤血管生長(zhǎng)的抑制因子，在體外它可以抑制正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的捕獲和凋亡，且減少內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲和血管的形成；而在體內(nèi)可以抑制多種原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)

2、。如果它可以抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，那么血管抑素的抗腫瘤血管生成治療將有望成為乳腺癌治療的新途徑。本研究旨在探討血管抑素(angiostatin)的基因?qū)雽?duì)乳腺癌的血管生成及乳腺癌生長(zhǎng)抑制的作用。 方法: 1、細(xì)胞培養(yǎng)：SD鼠的乳腺腫瘤細(xì)胞SHZ88細(xì)胞，于含10％小牛血清100IU/ml青霉素和100ug/ml的鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO<,2>，實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，調(diào)整濃度為5

3、×10<'6>個(gè)細(xì)胞/100ul生理鹽水，用于建立動(dòng)物模型。 2、動(dòng)物模型的建立：出生3-4天的SD鼠共30只，每只SD鼠頸部取一點(diǎn)皮下注射細(xì)胞懸液100ul。當(dāng)腫瘤細(xì)胞注射一周后，即鼠體內(nèi)的腫瘤大約長(zhǎng)至0.4cm時(shí)，將荷瘤的SD鼠隨機(jī)分成兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為血管抑素基因?qū)虢M和空白對(duì)照組，每組15只。 3、血管抑素的基因?qū)牒腕w內(nèi)實(shí)驗(yàn)：通過(guò)重組的腺相關(guān)病毒載體將血管抑素導(dǎo)入體內(nèi)。血管抑素基因?qū)虢M，在腫瘤細(xì)胞注射后的第7

4、、14、21、28天各進(jìn)行一次重組有血管抑素基因的重組腺相關(guān)病毒載體(AAV-ANG)的腫瘤內(nèi)注射，每次注射的劑量為2×10<'9>pfu；空白對(duì)照組，腫瘤內(nèi)每次只注射100ul生理鹽水。 4、測(cè)量腫瘤的體積、繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)：動(dòng)物模型建立后，每天監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況和SD大鼠的生存情況，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤的最長(zhǎng)、最短徑，計(jì)算腫瘤的體積及生長(zhǎng)抑制率，繪制皮下腫瘤體積一時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 5、病理組織學(xué)檢查：處死SD鼠

5、，觀察移植瘤的形態(tài)。取腫瘤組織固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋，組織切片，常規(guī)HE染色，組織病理檢查。 6、CD34免疫組化染色：運(yùn)用SABC法，通過(guò)抗CD34的兔抗大鼠抗體對(duì)腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色。 7、微血管密度的檢測(cè)：通過(guò)顯微圖象分析系統(tǒng)對(duì)微血管密度進(jìn)行分析。 8、腫瘤內(nèi)AAV-ANG導(dǎo)入的檢測(cè)：運(yùn)用SP法通過(guò)抗AAV-ANG的小鼠抗大鼠的抗體對(duì)腫瘤內(nèi)導(dǎo)入的AAV-ANG進(jìn)行檢測(cè)。 9、統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)處理：用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用Students’T檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著意義。 結(jié)果: 1、血管抑素的基因?qū)雽?duì)鼠體內(nèi)乳腺移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并且隨著注射次數(shù)的增加，血管抑素對(duì)腫瘤的抑制率也增加。此外，實(shí)驗(yàn)中還觀察到空白對(duì)照組帶瘤生存的時(shí)間為36天，而血管抑素基因?qū)虢M帶瘤生存時(shí)間為56天，腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的血管抑素基因?qū)肟赡苎娱L(zhǎng)鼠帶瘤生存的時(shí)間。 2、病理學(xué)

7、特征：在SD鼠接種的5天左右頸部可見(jiàn)到腫塊，且腫瘤隨時(shí)間的增加而增大。處死SD鼠，取出腫瘤組織，肉眼可見(jiàn)血管抑素基因?qū)虢M的腫瘤組織呈蒼白色，與皮膚不粘連，切面可見(jiàn)壞死現(xiàn)象，而空白對(duì)照組的腫瘤組織呈鮮紅色，與皮膚有部分粘連，切面可見(jiàn)大量的出血。光鏡下特點(diǎn)：HE染色所示，血管抑素基因?qū)虢M可見(jiàn)大量的組織壞死，其周?chē)黾?xì)胞核固縮并崩解，因此隨處可見(jiàn)細(xì)胞核碎片。空白對(duì)照組的核染色質(zhì)多呈粗塊狀，核分裂相多見(jiàn)，異質(zhì)性非常明顯，并多處可見(jiàn)粉紅色的微