內(nèi)皮抑素對宮頸癌移植瘤模型生長轉(zhuǎn)移的抑制作用及相關(guān)機制.pdf

1、宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位。手術(shù)及放射治療是宮頸癌的主要治療手段,但宮頸癌常發(fā)生局部侵犯和淋巴轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療失敗。宮頸癌對一般的化療藥物又不敏感,所以,尋求新的治療方法很有必要。
　　 與許多實體腫瘤一樣,宮頸癌組織內(nèi)同樣存在著血管、淋巴管的新生,血管、淋巴管密度與其惡性程度和生物學(xué)特性密切相關(guān)。因此,抑制宮頸癌血管和淋巴管生成可能會抑制腫瘤的進(jìn)展。目前,抗血管形成治療已有多種藥物問世,但尚

2、無特異的抗淋巴管形成制劑。內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性血管生成抑制劑,亦是目前多種具有抑制腫瘤血管活性成分中最為理想的因子。但尚未見內(nèi)皮抑素對宮頸癌的生長、轉(zhuǎn)移有無影響的文獻(xiàn)報導(dǎo)及與放化療聯(lián)合應(yīng)用有無增效作用。本研究旨在通過體外及體內(nèi)實驗,闡明內(nèi)皮抑素對宮頸癌進(jìn)展的影響及其分子機制,為尋求宮頸癌新的治療方法提供依據(jù)。研究分為三部分:
　　 第一部分重組人內(nèi)皮抑素對宮頸癌細(xì)胞HeLa生長侵襲的影響
　　 目的:檢測和觀察內(nèi)皮抑素對

3、HeLa細(xì)胞的增殖、侵襲以及超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 方法:體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞,加入重組人內(nèi)皮抑素,采用MTT法測定細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡;基底膜重建實驗檢測細(xì)胞移行;掃描及透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 1內(nèi)皮抑素對HeLa細(xì)胞增殖的影響
　　 應(yīng)用MTT法結(jié)果顯示,加入重組人內(nèi)皮抑素(20、10、5、1、0.5、0.1ug/mL)分別作用24h,48h,72h,與對

4、照組比較,細(xì)胞增殖受到不同程度抑制,其抑制效果隨作用濃度增加而加大且作用48h其抑制作用最顯著。作用24h重組人內(nèi)皮抑素濃度小于0.5ug/mL時,與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。作用48h各濃度均有抑制作用,與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。作用72h重組人內(nèi)皮抑素濃度小于1ug/mL時,與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 2內(nèi)皮抑素對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 與對照組相

5、比,在給藥后24和48小時,內(nèi)皮抑素組細(xì)胞G0/G1期比例增高,而S期細(xì)胞比例降低(p＜0.05)。72小時兩組無差別。
　　 在內(nèi)皮抑素處理24小時即可出現(xiàn)凋亡細(xì)胞群。之后,凋亡率逐漸下降,24小時和48小時的凋亡率分別為1.45±0.149％和1.88+0.076％,均顯著高于對照組(0.69+0.182％和1.37±0.142％,p＜0.05)。72小時兩組之間無差別。
　　 3內(nèi)皮抑素對HeLa細(xì)胞移行的影響

6、r>　　 內(nèi)皮抑素組(0.1,0.5,1,5,10ug/mL)的移行抑制率分別為22.66％,33.59％,73.44％,80.86％,94.14％。實驗組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05),各內(nèi)皮抑素組之間比較差異也有顯著性(p＜0.05)。這一結(jié)果提示內(nèi)皮抑素以濃度依賴方式抑制HeLa細(xì)胞的移行。
　　 4內(nèi)皮抑素對HeLa細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 掃描電子顯微鏡下:對照組可見粗壯的偽足,數(shù)目較多,有較明顯的

7、突起,分布密集。加入內(nèi)皮抑素后,HeLa細(xì)胞偽足成細(xì)絲狀,突起數(shù)量減少。
　　 透射電子顯微鏡下:對照組細(xì)胞呈圓或橢圓形,胞質(zhì)豐富,內(nèi)有線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、溶酶體。細(xì)胞核不規(guī)則,偶有雙核,在核旁的胞質(zhì)里可見微絲、微管。內(nèi)皮抑素組細(xì)胞則出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象且核膜旁胞質(zhì)內(nèi)的微絲束消失。
　　 結(jié)論:
　　 1重組人內(nèi)皮抑素在體外輕度抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖,對其侵襲的抑制作用則呈劑量依賴關(guān)系。
　　

8、 2重組人內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡,增加G0/G1期細(xì)胞而減少S期細(xì)胞數(shù)量。
　　 3重組人內(nèi)皮抑素改變HeLa細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)。
　　 第二部分重組人內(nèi)皮抑素對裸鼠宮頸癌移植瘤血管、淋巴管形成的抑制作用及機制
　　 目的:探討重組人內(nèi)皮抑素對其微血管密度、微淋巴管密度的影響,并進(jìn)一步檢測對腫瘤細(xì)胞內(nèi)皮生長因子VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表達(dá)情況的影響
　　 方法:
　　 1以HeL

9、a細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型,分為對照組和內(nèi)皮抑素組,分別以CD31和LYVE-1標(biāo)記血管和淋巴管,檢測內(nèi)皮抑素對血管、淋巴管形成的影響。
　　 2采用免疫組織化學(xué)方法檢測內(nèi)皮抑素對宮頸癌裸鼠移植腫瘤VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表達(dá)的影響。
　　 3采用Western blotting方法檢測內(nèi)皮抑素對HeLa細(xì)胞VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1內(nèi)皮抑素

10、組、生理鹽水組裸鼠腫瘤MVD平均值分別為10.83±2.29和22.08±1.93(P＜0.01)。內(nèi)皮抑素組、生理鹽水組裸鼠腫瘤MLD平均值為6.00±0.63和13.67±1.21(P＜0.05)。淋巴管主要分布在腫瘤間質(zhì)中并呈擴張狀態(tài),在腫瘤實質(zhì)內(nèi)很少發(fā)現(xiàn)。在陽性淋巴管的管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)有癌細(xì)胞存在。
　　 2體內(nèi)實驗中,VEGF-A表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和部分血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,顯示為棕黃色的顆粒。內(nèi)皮抑素組的VEGF-A陽性細(xì)胞

11、的平均光密度值明顯小于生理鹽水組(P＜0.05)。VEGF-C,D都表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。內(nèi)皮抑素組VEGF-C,D的陽性細(xì)胞的平均光密度值均明顯小于生理鹽水組(P＜0.05)。
　　 3體外實驗中,對照組VEGF-A的表達(dá)水平比內(nèi)皮抑素組高1.3倍;而對照組VEGF-C,D的表達(dá)水平分別比內(nèi)皮抑素組高1.26倍和3.65倍。
　　 結(jié)論:
　　 1內(nèi)皮抑素具有抑制HeLa裸鼠皮下移植瘤血管和淋巴管生成的雙重

12、作用。
　　 2內(nèi)皮抑素在體內(nèi)及體外均抑制HeLa細(xì)胞VEGF-A,C,D的表達(dá),可能由此而抑制血管和淋巴管生成,進(jìn)而抑制腫瘤向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　 第三部分重組人內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療對裸鼠宮頸癌移植瘤生長轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　 目的:探討重組人內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療對宮頸癌移植瘤生長轉(zhuǎn)移的影響
　　 方法:建立動物模型,分為四組:對照組,同步放化療組,內(nèi)皮抑素組和內(nèi)皮抑素聯(lián)合放化療組。采用精諾真體內(nèi)成像系

13、統(tǒng)、免疫組織化學(xué)、TUNEL、透射電子顯微鏡等技術(shù)檢測各組腫瘤生長、轉(zhuǎn)移情況,并檢測乏氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等因子的表達(dá)水平以及腫瘤凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1從第3周開始,內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療組與其他三組出現(xiàn)差異。實驗結(jié)束時,第2、3、4組的光子數(shù)與對照組相比明顯降低(P＜0.05)。而在第2、3、4組中,第4組(內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療組)腫瘤的生長抑制最為顯著(P＜0.05)。

14、
　　 2內(nèi)皮抑素組和內(nèi)皮抑素聯(lián)合放化療組的實驗鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)各為25％(2/8),比同步放化療組(42.8％,3/7)及對照組(66.7％,4/6)顯著降低(p＜0.05)。
　　 3 PCNA在內(nèi)皮抑素聯(lián)合放化療組中的表達(dá)明顯低于對照組(p＜0.01)、同步放化療組(p＜0.05)及單純使用內(nèi)皮抑素組(p＜0.01)。第2組中PCNA的表達(dá)低于對照組和第3組(p＜0.05)。HIF-1α在第3組和第4組中的表達(dá)明顯比

15、1、2組(p＜0.05)降低。
　　 4凋亡指數(shù)在第2、3、4組中分別是8.08±1.75％,10.99±2.86％和19.66±3.79％。這些指數(shù)均高于對照組的3.45±1.48％。第4組的凋亡指數(shù)明顯高于第2、3組(P＜0.05)。
　　 5透射電鏡下:內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療組的裸鼠腫瘤有較多凋亡細(xì)胞。低倍觀察可見核染色質(zhì)固縮,電子密度增高,細(xì)胞核碎裂,線粒體髓樣化;高倍觀察可見核碎裂塊,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,有脫顆

16、?，F(xiàn)象,線粒體髓樣化。
　　 而在對照組內(nèi)可見大量變性壞死的細(xì)胞,低倍觀察細(xì)胞膜局部有缺損,胞質(zhì)輕度水腫,局部區(qū)域變性壞死無結(jié)構(gòu)。高倍觀察可見線粒體大部分嵴消失,線粒體膜缺損,線粒體髓樣化,胞質(zhì)水腫有變性壞死,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張,有脫顆?，F(xiàn)象。內(nèi)皮抑素組和同步放化療組介于兩者之間。結(jié)論:
　　 1內(nèi)皮抑素聯(lián)合同步放化療治療宮頸癌可能對腫瘤生長轉(zhuǎn)移產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。
　　 2內(nèi)皮抑素對放療、化療(順鉑)有增敏作用。