環(huán)淫羊藿苷元抗炎、免疫抑制作用研究.pdf

1、第一章：環(huán)淫羊藿苷元抗炎作用及其機(jī)制研究
　　 一、目的：
　　 巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)在炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用。傳統(tǒng)中藥淫羊藿表現(xiàn)出多種藥理學(xué)作用。在本研究中我們通過建立脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞株RAW264.7活化，角叉菜膠小鼠足墊注射誘導(dǎo)的體內(nèi)、體外炎癥模型來觀察環(huán)淫羊藿苷元的抗炎作用并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 二、方法：
　　 培養(yǎng)RAW264

2、.7細(xì)胞，預(yù)先加入環(huán)淫羊藿苷元孵育2小時(shí)(濃度為0.8、4、20μM)，后加入終濃度為200 ng/ml的LPS刺激，建立細(xì)胞炎癥模型。采用ELISA的方法測定培養(yǎng)上清液中TNF-α濃度，RT-PCR方法測定COX-2的mRNA表達(dá)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)測定iNOS、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、IκBα、NF-κBp65亞基的表達(dá)。
　　 連續(xù)口服灌胃給予環(huán)淫羊藿苷元7天，小鼠足墊注射角叉菜膠引起急性炎癥，產(chǎn)生足墊腫脹

3、，游標(biāo)卡尺測定足墊前后厚度計(jì)算腫脹率。
　　 三、結(jié)果：
　　 1、RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下分泌大量TNF-α，并引起COX-2 mRNA表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)。環(huán)淫羊藿苷元預(yù)孵育能劑量依賴性的減低RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下生成TNF-α，降低炎癥介質(zhì)COX-2 mRNA表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)。
　　 2、RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下引起p38MAPK，ERK1/2、JNK磷酸化表達(dá)。環(huán)淫

4、羊藿苷元能劑量依賴性降低p38MAPK磷酸化表達(dá)，但對(duì)ERK1/2、JNK磷酸化表達(dá)無影響。
　　 3、RA4264.7細(xì)胞在LPS刺激下引起IκBα的降解和NF-κBp65亞基的核轉(zhuǎn)位。環(huán)淫羊藿苷元能減弱IκBα的降解和NF-κBp65亞基的核轉(zhuǎn)位。
　　 4、環(huán)淫羊藿苷元能減輕角叉菜膠引起急性足腫脹。
　　 四、結(jié)論：
　　 1、環(huán)淫羊藿苷元在體內(nèi)、體外表現(xiàn)出抗炎作用。
　　 2、環(huán)淫羊藿苷元

5、可能通過抑制p38MAPK通路和NF-κB通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞活化的抑制。
　　 第二章：環(huán)淫羊藿苷元免疫抑制作用及其機(jī)制研究
　　 一、目的：
　　 T淋巴細(xì)胞的活化表現(xiàn)為細(xì)胞克隆增殖和分泌細(xì)胞因子，是免疫應(yīng)答的重要環(huán)節(jié)。前期研究表明環(huán)淫羊藿苷元表現(xiàn)出免疫抑制效應(yīng)。本研究利用分離的小鼠脾臟細(xì)胞及人白血病T細(xì)胞株(Jurkat細(xì)胞)觀察環(huán)淫羊藿苷元對(duì)淋巴細(xì)胞活化的影響，探討可能的機(jī)制。同時(shí)觀察在整體動(dòng)物上淫羊藿苷

6、元對(duì)卵清蛋白誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的效應(yīng)。
　　 二、方法：
　　 體外分離和培養(yǎng)小鼠脾臟細(xì)胞，預(yù)先加入環(huán)淫羊藿苷元孵育2小時(shí)，以刀豆蛋白A(ConA)刺激脾細(xì)胞的活化。采用MTT方法測定脾細(xì)胞增殖，ELISA方法測定細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2的濃度，流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞早期活化蛋白CD69的表達(dá)，觀察藥物干預(yù)對(duì)脾臟細(xì)胞活化的影響。
　　 不同種屬的小鼠脾臟細(xì)胞等量混合，建立混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，預(yù)先加入環(huán)淫羊藿

7、苷元，觀察藥物干預(yù)對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響。
　　 自卵清蛋白對(duì)小鼠致敏首日，灌胃給予環(huán)淫羊藿苷元連續(xù)7天至抗原激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，測定DTH反應(yīng)引起的足墊腫脹率，觀察藥物干預(yù)對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響。
　　 以CD3/CD28或佛波醇酯PMA激活Jurkat細(xì)胞，用Western Blot方法測定Jurkat細(xì)胞中p38MAPK，ERK蛋白磷酸化的表達(dá)。觀察藥物干預(yù)對(duì)Jurkat細(xì)胞激活的影響。
　　 三、結(jié)果：

8、
　　 1、刀豆蛋白A(ConA)刺激脾細(xì)胞的活化，引起細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2分泌及T淋巴細(xì)胞表達(dá)早期活化蛋白CD69。環(huán)淫羊藿苷元能劑量依賴性抑制T淋巴細(xì)胞激活引起的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2分泌，減少T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD69。
　　 2、環(huán)淫羊藿苷元能劑量依賴性抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)引起的增殖。
　　 3、環(huán)淫羊藿苷元能劑量依賴性抑制卵清蛋白在小鼠足墊上誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。