人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清的免疫抑制作用研究.pdf

1、目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響；探究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)誘導(dǎo)活化后的PBMC殺傷腫瘤細(xì)胞功能的影響。
　　方法:一．人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究。
　　利用組織塊貼壁法分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并利用傳代純化篩選出能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的hUC-MSC；倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)hUC-MSCs的免疫表型；應(yīng)用不同因子誘

2、導(dǎo)hUC-MSCs向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化并進(jìn)行鑒定。
　　二．hUC-MSCs對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）各淋巴細(xì)胞亞群比例的影響的研究。
　　通過密度梯度離心法分離PBMC，加入OKT3刺激，用含有hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理PBMC，F(xiàn)CM分析比較處理組和對(duì)照組各淋巴細(xì)胞亞群比例以及周期的變化；Annexin V/PI雙染確定PBMC的凋亡情況；ELISA法檢測(cè)MSC-C

3、M對(duì)PBMC分泌IFN-γ、IL-10的影響。
　　三．PGE2參與hUC-MSCs對(duì)Treg亞群比例的調(diào)節(jié)并影響PBMC的增殖活性。
　　在hUC-MSCs的培養(yǎng)體系中加入PGE2拮抗劑NS-398并收集培養(yǎng)2~3d后的hUC-MSC上清。用含此時(shí)收集的hUC-MSC上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為實(shí)驗(yàn)組，用含未處理過的hUC-MSCs培養(yǎng)上清的條件培養(yǎng)基作用于PBMC，作為對(duì)照組1，用正常DMEM/F12培養(yǎng)基作用于

4、PBMC，作為對(duì)照組2。FCM分析比較實(shí)驗(yàn)組和各對(duì)照組PBMC中Treg比例的變化；ELISA法檢測(cè)比較實(shí)驗(yàn)組和各對(duì)照組PBMC分泌IFN-γ、IL-10的水平。
　　四．hUC-MSCs上清與CIK及腫瘤細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系的相互作用研究。
　　密度梯度離心法分離PBMC，并誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CIK細(xì)胞免疫表型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hUC-MSCs培養(yǎng)上清作用后A549細(xì)胞周期的變化，MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞增

5、殖曲線；MTT法檢測(cè)hUC-MSCs培養(yǎng)上清對(duì)CIK殺傷A549細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：成功分離得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)細(xì)胞貼壁、呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)均一，高表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD73、CD105、CD44、CD29和黏附分子CD90，不表達(dá)CD14、MHCⅡ類分子HLA-DR和造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45，Gomori鈣鈷法、油紅O染色和阿利辛藍(lán)染色證實(shí)分離所得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；M

6、SC-CM下調(diào)了CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，上調(diào)了PBMC中CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞的含量，而對(duì)其他淋巴細(xì)胞亞群的比例無顯著影響，抑制了PBMC分泌IFN-γ的能力，但對(duì)IL-10的分泌有促進(jìn)作用，此外，MSC-CM對(duì)PBMC有保護(hù)作用，降低了PBMC在OKT3刺激下的凋亡程度。抑制劑NS-398的加入使MSC-CM上調(diào)Treg的能力下降，同時(shí)也抑制了上調(diào)PBMC分泌IL-10的能力，且使PBMC分泌IFN-γ

7、的水平得到恢復(fù)，NS398抑制試驗(yàn)確定了PGE2是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的介導(dǎo)因子；殺傷試驗(yàn)證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CIK的殺傷功能具有抑制作用，且此抑制作用可能被血清中和。
　　結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)可不依賴于與免疫細(xì)胞的直接或間接接觸，并且與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡無關(guān)，通過可溶性因子PGE2促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化可能是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的途徑之一，且此種抑制效應(yīng)能夠降低CI