青蒿琥酯、氧化苦參堿影響L929和Colon26細胞培養(yǎng)上清免疫抑制作用的研究.pdf

1、本研究擬用在預實驗中已篩到的，其培養(yǎng)上清確有免疫抑制作用的兩株腫瘤細胞，小鼠成纖維母細胞瘤細胞株L929和小鼠結(jié)直腸癌細胞株Colon26，作為研究用腫瘤細胞；選用已報道有一定抗瘤效應，但尚不知是否有逆轉(zhuǎn)腫瘤培養(yǎng)上清免疫抑制作用的兩種中藥提取成分，青蒿琥酯和氧化苦參堿，研究它們是否也具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞產(chǎn)生免疫抑制性培養(yǎng)上清的作用，為研究中藥抗瘤新機制和開辟篩選抗瘤中藥新途徑進一步提供實驗依據(jù)。 研究方法：選用L929和Colon2

2、6兩株腫瘤細胞以及兩種抗腫瘤中藥提取成分青蒿琥酯和氧化苦參堿，分別制備藥物作用一定時間后洗去藥物，再培養(yǎng)不同時間的腫瘤細胞培養(yǎng)上清。其中，青蒿琥酯、氧化苦參堿作用L929細胞24小時后洗去藥物，加入新鮮培養(yǎng)液，重新調(diào)整細胞濃度后，冉培養(yǎng)24小時(第一次再培養(yǎng))的上清稱為A-L1、O-L1，相應的以完全培養(yǎng)液代替藥物同步處理所獲的對照培養(yǎng)上清稱為control-L1；第一次再培養(yǎng)的腫瘤細胞以新鮮培養(yǎng)液重新調(diào)整細胞濃度后，再培養(yǎng)24小時(第

3、二次再培養(yǎng))的各相應的上清分別稱為A-L2、O-L2、control-L2；青蒿琥酯、氧化苦參堿作用Colon26細胞的各上清制備，除培養(yǎng)時間改為48小時外余均同上。第一次再培養(yǎng)所獲的各相應上清分別稱為A-C1、O-C1和control-C1，第二次再培養(yǎng)所獲的各相應上清分別稱為A-C2、O-C2和control-C2。MTT法檢測各上清對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化及對小鼠脾細胞NK殺傷活性的影響，流式細胞計數(shù)分析法檢測各上清對Con

4、A誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化中CD4+細胞及CD8+細胞百分率的影響。 研究結(jié)果： 1.各種L929細胞培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞免疫功能的影響。 1.1.對ConA誘導小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞ConA轉(zhuǎn)化對照組相比，control-L1和control-L2可明顯抑制ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化(抑制率分別為48.71±2.88％和53.83±3.42％，均P＜0.01)；與control-L1相

5、比，A-L1、O-L1對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制均明顯降低(抑制率分別為37.50±6.58％和38.11±6.00％，均P＜0.01)；與control-L2相比，A-L2、O-L2對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制均明顯降低(抑制率分別為48.71±3.52％和45.26±10.47％，均P＜0.01)。 1.2.對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化中CD4+細胞和CD8+細胞百分率的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞

6、ConA轉(zhuǎn)化對照組CD4+細胞的百分率(48.24±2.10％)相比，control-L1組和control-L2組中CD4+細胞的百分率均明顯降低(分別為22.72±2.61％和21.89±2.18％，均P＜0.01)；與control-L1組相比，A-L1組和O-L1組中CD4+細胞的百分率均明顯升高(分別為28.20±2.66％和25.91±2.03％，均P＜0.05)；與control-L2組相比，A-L2組和O-L2組中CD4

7、+細胞的百分率均明顯升高(分別為27.69±1.26％和25.68±2.67％，均P＜0.05)。對CD8+細胞百分率，A-L1組和O-L1組與control-L1組相比、A-L2組和O-L2組與control-L2組相比，均無顯著差異(均P＞0.05)。 1.3.對小鼠脾細胞NK殺傷活性的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞殺傷對照組(殺傷率為65.39±0.87％)相比，control-L1和control-L2均可明顯抑制小

8、鼠脾細胞NK殺傷活性(殺傷率分別為60.97±3.86％和59.59±3.13％，均P＜0.01)；與control-L1相比，A-L1組和O-L1組NK殺傷率均明顯升高(殺傷率分別為67.58±4.83％，P＜0.01；64.64±7.46％，P＜0.05)；與control-L2相比，A-L2組和O-L2組NK殺傷率均明顯升高(殺傷率分別為66.14±4.10％和68.63±4.10％，均P＜0.01)。 2.各種Colon

9、26細胞培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞免疫功能的影響。 2.1.對ConA誘導小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞ConA轉(zhuǎn)化對照組相比，control-C1和control-C2均可明顯抑制ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化(抑制率分別為46.63±7.68％和37.82±6.71％，均P＜0.01)；與control-C1相比，A-C1對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制明顯降低(抑制率為27.83±5.50％，P＜0.05)

10、，而O-C1對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制(抑制率為44.40±9.90％)與control-C1組無明顯差異(P＞0.05)；與control-C2相比，A-C2對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制明顯降低(抑制率為5.48±7.22％，P＜0.01)，而O-C2對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)化的抑制(抑制率為46.78±8.17％)與control-C2組無明顯差異(P＞0.05)。 2.2.對ConA誘導的小鼠脾細胞轉(zhuǎn)

11、化中CD4+細胞和CD8+細胞百分率的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞ConA轉(zhuǎn)化對照組CD4+細胞的百分率(48.24±2.10％)相比，control-C1組和control-C2組中CD4+細胞的百分率均明顯降低(分別為31.97±2.71％和33.98±1.53％，均P＜0.01)；與control-C1組相比，A-C1組中CD4+細胞的百分率均明顯升高(38.68±1.59％，P＜0.05)，而O-C1組中CD4+細胞的百分

12、率(34.77±3.31％)與control-C1組無明顯差異(P＞0.05)；與control-C2組相比，A-C2組中CD4+細胞的百分率明顯升高(40.35±2.59％，P＜0.05)，而O-C2組中CD4+細胞的百分率(33.53±2.69％)與control-C2組無明顯差異(P＞0.05)。A-C1組和O-C1組與control-C1組相比、A-C2組和O-C2組與control-C2組相比，CD8+細胞百分率均無顯著差異(

13、均P＞0.05)。 2.3.對小鼠脾細胞NK殺傷活性的影響：與無腫瘤上清作用的單純脾細胞殺傷對照組(殺傷率為69.84±7.71％)相比，control-C1和control-C2可明顯抑制小鼠脾細胞NK殺傷活性(殺傷率分別為49.62±6.77％和52.31±6.56％，P均＜0.01)；與control-C1組相比，A-C1組NK殺傷活性明顯升高(殺傷率為57.21±3.38％，P＜0.05)，而O-C1組(殺傷率45.42

14、±8.98％)無明顯差異(P＞0.05)；A-C2組和O-C2組NK殺傷率(分別為55.42±5.92％和47.47±9.24％)與control-C2組均無明顯差異(P＞0.05)。 研究結(jié)論： 1.L929和Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞的免疫功能具有明顯抑制作用。腫瘤細胞種類不同，其上清產(chǎn)生免疫抑制作用的出現(xiàn)時間、持續(xù)時間及抑制程度也不同。 2.青蒿琥酯作用L929和Colon26腫瘤細胞后可顯