HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清對肝細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)是引起肝臟疾病的重要病原體，感染者大部分發(fā)展為慢性感染，最后可導(dǎo)致肝纖維化，肝硬化和肝癌，而且目前還沒有有效的疫苗來預(yù)防HCV的感染。聚乙二醇化干擾素-α（pegylated interferonα，PEG-IFN-α）和利巴韋林(ribavirin，RBV)是治療丙肝的最佳藥物，但仍有約為30％-50％的HCV感染者對該聯(lián)合抗病毒治療無效。HCV core蛋白是病毒感染肝細(xì)胞后第

2、一個表達(dá)的蛋白，在感染的靶細(xì)胞和患者的血清中均可檢測到其存在。HCV core蛋白不僅參與病毒顆粒的組裝，還可與靶細(xì)胞不同蛋白相互作用調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能，包括細(xì)胞的增殖，生長，凋亡等。
　　固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線，肝臟組織中的庫否氏細(xì)胞是重要的固有免疫應(yīng)答細(xì)胞，屬于定居的巨噬細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫防御。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞是一類異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞群體，在組織微環(huán)境中可被刺激分化為具有不同功能的細(xì)胞亞群。包括經(jīng)典活

3、化的M1巨噬細(xì)胞、旁路活化的M2巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞等。本室前期結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，HCV core蛋白可刺激巨噬細(xì)胞THP1分泌促炎和抑炎因子，因此，本研究擬通過收集HCV core蛋白作用的THP1上清，從不同的角度觀察培養(yǎng)上清對正常肝細(xì)胞株L02、肝癌細(xì)胞株(HepG2、SMCC-7721)的增殖、遷移、侵襲以及對干擾素作用的影響，并初步探討其機(jī)制，為進(jìn)一步研究HCV core蛋白對巨噬細(xì)胞活性的影響提供實驗依據(jù)。
　　方

4、法:
　　1、構(gòu)建與表達(dá)重組HCV core蛋白
　　從JFH-1株(HCV2a)全長基因質(zhì)粒上通過PCR的方法擴(kuò)增HCV core基因，連接至pMD18-T載體上，測序正確后，經(jīng)BamHⅠ，HindⅢ雙酶切，與pET28a相連，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HCV core，雙酶切鑒定。經(jīng)IPTG37℃誘導(dǎo)獲得表達(dá)core蛋白的包涵體，經(jīng)純化，復(fù)性和濃縮后，行SDS-PAGE和Western blot鑒定。
　　

5、2、獲得HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞m-THP1培養(yǎng)上清
　　PMA(10 ng/ml)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP1分化為巨噬細(xì)胞m-THP1，HCV core蛋白以20μg/ml刺激m-THP124h后收集上清，離心。-80℃保存?zhèn)溆?。同時設(shè)PBS陰性對照組與加HCV core蛋白無細(xì)胞的空白對照組。
　　3、觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清對肝細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清用完全培養(yǎng)基20％或50％稀釋后分別培養(yǎng)

6、人正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞HepG2或SMMC7721細(xì)胞:1）通過細(xì)胞增殖實驗(CCK8法)，劃痕實驗，Transwell細(xì)胞遷移實驗及克隆增殖實驗觀察稀釋后的培養(yǎng)上清對上述肝細(xì)胞細(xì)胞增殖，遷移能力的影響;2）通過實時定量PCR檢測三種肝細(xì)胞株MMP2和MMP9基因的表達(dá)變化;3）Westernblot檢測三種肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65及MAPKs通路相關(guān)蛋白(ERK，JNK，p38)的表達(dá)。
　　4、觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清和

7、IFN-α對肝細(xì)胞增殖的影響
　　在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別培養(yǎng)L02、HepG2和SMCC7721三種肝細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基（含IFN-α1000 U/孔），1h后加入不同組分的細(xì)胞培養(yǎng)上清，使各孔終體積均為200 ul，分別在刺激肝細(xì)胞24h、48h時檢測其增殖變化。以了解在core蛋白作用的THP1產(chǎn)物對干擾素抗病毒作用的影響。設(shè)組情況如下:core蛋白作用的THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清+IFN-α刺激組為實驗組，同時設(shè)IF

8、N-α單獨(dú)刺激組、core蛋白作用的THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激組、THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清+IFN-α刺激組為對照組。
　　結(jié)果:
　　1、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HCV core（含有2個His標(biāo)簽），經(jīng)BamHⅠ,HindⅢ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳有約575bp大小片段存在，測序結(jié)果顯示與Genbank記載序列一致。
　　2、獲得原核表達(dá)重組蛋白HCV core，純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blo

9、t結(jié)果顯示獲得分子量約為21KD的單一條帶，并測得其濃度為0.5μg/μl。
　　3、HCV core蛋白作用的m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清明顯促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲:1）與對照組相比，50％稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清時可促進(jìn)L02、HepG2以及SMMC7721細(xì)胞的增殖(P＜0.05);2)在劃痕實驗和遷移試驗中，與對照組相比，20％稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠明顯促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞的遷移(P＜0.01)，50％稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清可

10、明顯促進(jìn)L02細(xì)胞的遷移(P＜0.01)，兩種濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清對HepG2細(xì)胞的遷移無影響。在平板克隆形成試驗中，對三種細(xì)胞均無明顯影響。
　　4、HCV core蛋白作用的m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清可干擾IFN-α抑制肝細(xì)胞增殖的作用:與對照組相比，IFN-α（1000U/孔）可明顯抑制肝細(xì)胞的增殖，而core蛋白作用的m-THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠干擾IFN-α的這種抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　5、實時定量PCR結(jié)果

11、顯示:與純粹的m-THP1的細(xì)胞培養(yǎng)上清和HCV core空培養(yǎng)基對照組相比，20％稀釋的核心蛋白刺激下的m-THP1上清作用可顯著促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞MMP9的表達(dá)(P＜0.05); L02和HepG2細(xì)胞MMP9和MMP2的表達(dá)水平與對照組相比并無顯著變化。
　　6、core蛋白作用m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清作用SMMC-7721細(xì)胞，檢測相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，Western blot結(jié)果顯示，與PBS作用m-THP1的細(xì)胞培

12、養(yǎng)上清和HCV core空培養(yǎng)基對照組相比，core蛋白作用m-THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清后可使p-ERK的表達(dá)明顯降低，p-38的表達(dá)并無明顯變化，磷酸化的NF-κB65表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建、表達(dá)了HCV core蛋白。
　　2、HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清可促進(jìn)L02、HepG2、SMMC-7721的增殖;促進(jìn)L02、SMMC-7721的遷移可能與NF-κB存在一定關(guān)聯(lián)。
　　3、