青蒿琥酯、氧化苦參堿對L929腫瘤細胞免疫抑制作用影響及相關(guān)分子機制研究.pdf

1、目的：腫瘤是當(dāng)今嚴重危害人類生命健康的重大疾病，發(fā)病率和死亡率都很高。用藥物治療腫瘤，是腫瘤治療的重要措施。中藥是我國寶貴的醫(yī)藥資源，研究抗瘤中藥是研究抗瘤藥物的重要領(lǐng)域。 本室前期研究發(fā)現(xiàn)，L929腫瘤細胞(小鼠成纖維母細胞瘤)培養(yǎng)上清有免疫抑制作用，提示其有免疫抑制分子分泌。青蒿琥酯和氧化苦參堿，是兩個有一定抗瘤作用的市售中藥制劑，但目前國內(nèi)外尚無青蒿琥酯和氧化苦參堿對L929腫瘤細胞免疫抑制作用影響及相關(guān)分子機制的研究報道

2、。為此，本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，研究青蒿琥酯和氧化苦參堿對L929腫瘤細胞免疫抑制作用影響及相關(guān)分子機制，為進一步深入揭示這兩種中藥制劑的抗瘤機理，指導(dǎo)臨床正確選擇和合理使用，提供實驗和理論依據(jù)。 方法：分別以含選定濃度青蒿琥酯(ART)或氧化苦參堿(MOX)的培液培養(yǎng)L929腫瘤細胞24h后，洗滌去除中藥制劑，細胞再用不含中藥制劑的培液連續(xù)作兩次24h的再培養(yǎng)，分別留取第一次和第二次再培養(yǎng)的細胞和培養(yǎng)上清。其中，經(jīng)ART作用

3、后第一次再培養(yǎng)的細胞稱為A-C1，第二次再培養(yǎng)的細胞稱為A-C2，相應(yīng)的上清分別稱為A-S1和A-S2：經(jīng)MOX作用后再培養(yǎng)的細胞分別稱為O-C1和O-C2，上清分別稱為O-S1和O-S2。以不含中藥制劑培液作同步對照培養(yǎng)的細胞分別稱為C-C1和C-C2，上清分別稱為C-S1和C-S2。實驗研究這些上清對小鼠脾細胞MTT法測定的NK殺傷和ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，以及直接免疫熒光FCM法分析的CD4+、CD8+、IL-2Rα、CD3ε+ζ+和C

4、D3ε-ζ+表達共7項免疫功能指標的影響；定量ELISA法測定這些上清中TGF-β1、PGE2、VEGF和IL-10共4種免疫抑制分子的含量；以β-actin作內(nèi)參照，RT-PCR法檢測細胞中受影響最大的免疫抑制分子或其胞內(nèi)合成限速酶的mRNA表達，表達強度以相對表達系數(shù)RC表示。將這些上清免疫抑制作用變化與相應(yīng)上清中免疫抑制分子含量變化列表進行專業(yè)比對分析，以最大相似性推測兩者的關(guān)系，然后作單因素相關(guān)統(tǒng)計分析，確定中藥制劑影響L929

5、腫瘤細胞對不同免疫功能指標免疫抑制作用的相關(guān)免疫抑制分子；將受影響最大的免疫抑制分子的上清中含量與其相應(yīng)細胞內(nèi)mRNA或其胞內(nèi)合成限速酶mRNA表達強度進行單因素相關(guān)統(tǒng)計分析，明確中藥制劑下調(diào)該分子分泌是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平還是基因轉(zhuǎn)錄后水平。 結(jié)果： 1.L929單純腫瘤細胞培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞免疫功能指標的影響 在以培液代替L929單純腫瘤細胞培養(yǎng)上清的正常對照(C-nS)組，小鼠脾細胞NK殺傷率、ConA誘導(dǎo)

6、轉(zhuǎn)化的A值和CD4+、CD8+、IL-2Rα、CD3ε+ζ+、CD3ε-ζ+表達細胞百分率分別為(65.39±0.87)％、0.925±0.026、(48.24±2.10)％、(19.23±0.60)％、(26.50±0.85)％、(21.67±1.29)％和(16.33±0.18)％。與C-nS組相比，在以不含中藥制劑培液作同步對照培養(yǎng)的L929單純腫瘤細胞培養(yǎng)上清(C-S1、C-S2)組，均可使所檢測的這7項免疫功能指標明顯受抑：C

7、-S1組分別為(60.97±3.86)％(P<0.01)、0.440±0.038(P<0.01)、(22.72±2.61)％(P<0.01)、(11.42±1.25)％(P<0.01)、(10.39±0.49)％(P<0.001)、(7.89±0.78)％(P<0.001)和(10.93±0.16)％ (P<0.001)，抑制率分別為(8.34±4.55)％、(47.88±1.89)％、(53.00±3.37)％、(40.71±4.65

8、)％、(59.91±0.77)％、(63.33±5.77)％和(33.05±1.52)％；C-S2組分別為(59.59±3.13)％(P<0.01)、0.441±0.047(P<0.001)、(21.89±2.18)％(P<0.01)、(12.15±0.65)％(P<0.01)、(9.76±0.94)％(P<0.001)、(7.45±0.54)％(P<0.001)和(10.75±0.59)％(P<0.001)；抑制率分別為(9.79±3

9、.95)％、(48.00±2.16)％、 (54.69±2.55)％、 (36.85±1.41)％、(61.49±0.85)％、(65.63±0.87)和(33.32±0.25)％；而C-S1組與C-S2組無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。 2.青蒿琥酯或氧化苦參堿作用后L929再培養(yǎng)上清對小鼠脾細胞免疫功能指標的影響 經(jīng)青蒿琥酯作用后的L929腫瘤細胞：(1)其第一次再培養(yǎng)上清(A-S1)與相應(yīng)對照上清(C-S1)相比，

10、除對CD8+表達的抑制作用無明顯改變(P>0.05)外，對其余6項免疫功能指標的抑制作用均明顯降低(分別為P<0.001，P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.001，P<0.01)；(2)其第二次再培養(yǎng)上清(A-S2)與A-S1相比：①對CD8+表達的抑制作用明顯上升(P<0.05)；②對CD3ε+ζ+表達的抑制作用明顯回升(P<0.01)，但未至相應(yīng)對照C-S2水平(P<0.01)；③對NK殺傷、ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和CD4

11、+、IL-2Rα和CD3ε-ζ+表達的抑制均無顯著變化(均P>0.05)。 經(jīng)氧化苦參堿作用后的L929腫瘤細胞：①其第一次再培養(yǎng)上清(O-S1)與相應(yīng)對照上清(C-S1)相比，除對CD8+表達的免疫抑制作用無明顯變化(P>0.05)外，對其余6項免疫功能指標的免疫抑制作用均明顯降低(分別為P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.001，P<0.01)；②其第二次再培養(yǎng)上清(O-S2)與O-S1相比，除對

12、CD3ε+ζ+表達的抑制作用明顯回升外(P<0.05；但未至相應(yīng)對照上清C-S2水平，P<0.01)，對其余6項免疫功能指標(NK殺傷、ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和CD4+、CD8+、IL-2Rα和CD3ε-ζ+表達)的抑制作用均無顯著變化(均P>0.05)。 3.青蒿琥酯或氧化苦參堿對L929腫瘤細胞4種免疫抑制分子分泌的影響 未經(jīng)中藥制劑作用的L929腫瘤細胞可穩(wěn)定分泌所測的4種免疫抑制分子(C-S1與C-S2相比，P>0.0

13、5)，以TGF-β1及PGE2含量最高，分別為(198.15±3.23)pg/ml和(133.76±5.16)pg/ml，VEGF和IL-10含量較低，分別為(33.38±0.59)pg/ml和(27.31±0.37)pg/ml。 經(jīng)青蒿琥酯作用后的L929腫瘤細胞：①其第一次再培養(yǎng)上清(A-S1)與相應(yīng)對照上清(C-S1)相比：4種免疫抑制分子的濃度均明顯降低，分別為(99.05±8.02)pg/ml(P<0.001，降低50

14、.01％)、(66.57±4.71)pg/ml(P<0.001，降低50.23％)、(21.03±0.87)pg/ml(P<0.01，降低36.99％)和(22.89±0.57)pg/ml(P<0.01，降低16.18％)；②其第二次再培養(yǎng)上清(A-S2)與A-S1相比，除IL-10含量明顯上升(P<0.05)外，其余3種分子含量無顯著變化(均P>0.05)。 經(jīng)氧化苦參堿作用后的L929腫瘤細胞：①其第一次再培養(yǎng)上清(O-S1

15、)與對照上清(C-S1)相比：4種免疫抑制分子的含量均明顯降低(均P<0.01)，分別為TGF-β1(91.35±9.62)pg/ml(降低53.89％)，PGE2，(69.43±2.32)pg/ml(降低48.23％)，VEGF(21.36±0.75)pg/ml(降低36.01％)和IL-10(22.84±0.33)pg/ml(降低16.37％)。②其第二次再培養(yǎng)上清(O-S2)與O-S1相比，4種免疫抑制分子含量均無顯著變化(均P>

16、0.05)。 4 青蒿琥酯和氧化苦參堿影響L929腫瘤細胞免疫抑制作用的相關(guān)分子分析 結(jié)論： 1.不經(jīng)ART或MOX作用的L929腫瘤細胞，其培養(yǎng)上清可顯著抑制所測小鼠脾細胞7項免疫功能指標(ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、NK殺傷及CD4+、CD8+、IL-2Ra、CD3ε+ζ+和CD3ε-ζ+表達)；經(jīng)ART或MOX作用后再培養(yǎng)的L929腫瘤細胞，其培養(yǎng)上清對這7項免疫功能指標的抑制作用顯著降低。 2.不經(jīng)ART或

17、MOX作用的L929腫瘤細胞能穩(wěn)定分泌所測4種免疫抑制分子(TGF-β1、PGE2、VEGF和IL-10)；ART或MOX均能顯著下調(diào)L929腫瘤細胞這4種免疫抑制分子分泌。 3.ART下調(diào)L929腫瘤細胞對小鼠脾細胞ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化、NK殺傷和IL-2Rα、CD4+及CD3ε-ζ+表達的免疫抑制作用的相關(guān)分子是TGF-β1和PGE2。 4 MOX下調(diào)L929腫瘤細胞對小鼠脾細胞ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和IL-2Rα、CD4+及