免疫缺陷鼠-人RA移植物嵌合體模型的研制及應(yīng)用.pdf

1、一．背景和目的 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為病理中心的自身免疫性疾病?；ぴ錾⑿纬裳荇枋擒浌呛凸琴|(zhì)破壞的關(guān)鍵因素。既往對(duì)RA的病理機(jī)制研究多強(qiáng)調(diào)RA的T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫炎癥反應(yīng)這一環(huán)節(jié)，滑膜成纖維樣細(xì)胞(SFs)只是當(dāng)作“被動(dòng)參與者”，受T細(xì)胞和炎癥因子刺激而出現(xiàn)增生和軟骨侵蝕。但近年來(lái)逐漸關(guān)注到RA滑膜成纖維樣細(xì)胞(RASFs)本身在RA病理進(jìn)程中的作用。由于RASFs具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征，即使在無(wú)T細(xì)胞和炎癥因

2、子的環(huán)境中，單純的RASFs同樣能增生并侵襲軟骨。因此提出，RASFs是一個(gè)“主動(dòng)入侵者”，在RA的病理機(jī)制是扮演關(guān)鍵角色。這也是臨床上應(yīng)用免疫抑制劑或抗炎鎮(zhèn)痛藥雖然能緩解癥狀，但最終并不能阻斷病情進(jìn)展和關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的原因?；诖?，尋找能真正抑制RA滑膜增生并阻斷軟骨和骨質(zhì)侵蝕進(jìn)程的藥物已成為RA研究的焦點(diǎn)。 要達(dá)到上述目標(biāo)，良好的動(dòng)物模型是不可缺少的技術(shù)平臺(tái)。既往各種誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型如膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎等，

3、它們的滑膜增生都是受免疫炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)，并不能體現(xiàn)RA滑膜自身增生和侵蝕。因此，上世紀(jì)90年代中期開(kāi)始，將RA滑膜移植到免疫缺陷動(dòng)物身上構(gòu)建免疫缺陷動(dòng)物-人RA移植物嵌合體模型的研究工作迅速得到重視。該模型在RA滑膜增生的病理機(jī)制，特別是篩選以抑制滑膜增生和軟骨侵蝕為目標(biāo)的藥物或治療方法中得到廣泛應(yīng)用。而國(guó)內(nèi)對(duì)該模型的研制工作才剛起步。免疫缺陷動(dòng)物主要有裸鼠，SCID(T、B細(xì)胞功能缺陷的聯(lián)合重度免疫缺陷)小鼠和NOD/SCID、：BNx

4、(T、B、NK細(xì)胞三缺陷)小鼠。目前廣泛應(yīng)用的是SCID小鼠，BNX鼠能否作為RA滑膜移植載體尚未見(jiàn)報(bào)道。既往我們實(shí)驗(yàn)顯示南蛇藤醇提物具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛和免疫抑制作用，但作為RA治療價(jià)值還有待觀察它是否能真正抑制RA滑膜增生和軟骨侵蝕。Etanercept是目前應(yīng)用最多的一種TNF-a拮抗劑，在RA的臨床治療中有顯著作用，但作為一種TNF-a受體融合蛋白能否真正抑制滑膜增生和軟骨侵蝕尚未見(jiàn)在體實(shí)驗(yàn)的直接依據(jù)。 為了進(jìn)一步了解RA

5、滑膜增生和軟骨侵蝕的機(jī)制，探討B(tài)NX鼠構(gòu)建免疫缺陷鼠/人RA移植物模型的可行性，觀察南蛇藤是否能真正抑制RA滑膜增生和軟骨侵蝕并探討其機(jī)制，深化Etanercept治療RA的藥理作用途徑，我們開(kāi)展了本項(xiàng)目的研究。 二．研究?jī)?nèi)容和方法 本研究主要有3個(gè)方面內(nèi)容： 一是構(gòu)建NOD/SCID鼠-人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎移植物嵌合體模型(NOD/SCID-HuRAg)，并與NOD/SCID鼠-人骨關(guān)節(jié)炎(OA)滑膜移植物模型進(jìn)行比

6、較； 二是以NOD/SCID-HuRAg模型評(píng)價(jià)南蛇藤醇提物治療RA的作用機(jī)制并與來(lái)氟米特對(duì)照： 三是以BNX-HuRAg模型評(píng)價(jià)Etanercept治療RA的作用及機(jī)制。 1．造模方法：將RA(或OA)患者關(guān)節(jié)鏡下鉗取的滑膜組織修剪成0.3×0.5cm大小，將截肢患者的正常關(guān)節(jié)軟骨修剪成0.5×0.8cm大小。戊巴比妥麻醉狀態(tài)下在NOD/SCID鼠或BNX鼠背部作縱行切口，將一塊軟骨植入皮下，再將兩塊滑膜組織置

7、入軟骨上，縫合切口。以上操作均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，動(dòng)物在SPF級(jí)屏蔽環(huán)境飼養(yǎng)管理。 2．給藥方法：NOD/SCID-HuRAg隨機(jī)分為3組，每組8只，術(shù)后第29d開(kāi)始分別給予蒸餾水，南蛇藤醇提物(30mg/d)及來(lái)氟米特(500ug/只)灌胃，每同1次，持續(xù)4周。BNX-HuRAg模型隨機(jī)分為2組，每組10只，術(shù)后第29d開(kāi)始分別給予Etanercept(100ug/只)和注射用水(對(duì)照)在移植物附近皮下注射，一周2次，連續(xù)4周。

8、 3.指標(biāo)檢測(cè)：術(shù)后第61d眼球取血，整體剝離滑膜軟骨移植物。血清標(biāo)本作TNF-a定量檢測(cè)(放免法)和細(xì)胞調(diào)亡程度(TUNEL法)。組織學(xué)評(píng)價(jià)主要包括滑膜增生，軟骨侵蝕和軟骨細(xì)胞周圍的軟骨降解三個(gè)內(nèi)容，分別采用積分表示病變程度。原位雜交片和細(xì)胞凋亡片經(jīng)自動(dòng)圖象分析，提取反映陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)弱的平均光密度值(MIOD)和陽(yáng)性信號(hào)多少的平均著色面積(MSA)作半定量分析。 4.統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差( +j)表

9、示，用SPSSl0.0軟件進(jìn)行分析。首批NOD/SCID-HuRAg模型與NOD/SCID-HuOAg模型組之間，以及Etanercept給藥的2組BNX-HuRAg模型之間的數(shù)據(jù)采用Independent-SamplesTTest檢驗(yàn)。南蛇藤給藥3組NOD/SCID-HuRAg模型之間的數(shù)據(jù)采用One WayANOVA方差分析，兩兩多重比較采用LSD法或SNK檢驗(yàn)，方差不齊性時(shí)采用Games--Howe Ⅱ檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

10、 三.結(jié)果 實(shí)驗(yàn)期間移植物均在小鼠體內(nèi)存活，小鼠未出現(xiàn)移植物抗宿主反應(yīng)。 1.NOD/SCID-HuRAg與NOD/SCID-HuOAg比較，前者滑膜增生(3.111±0.054 vs 2.000±1.000，p<0.05)，軟骨侵蝕(3.556±0.527vs 1.278±0.051，p<0.01)和軟骨降解的程度(3.111±0.782 vs 1.778±0.833，p<0.01)均較后者高，增多有顯著性意義

11、。前者的滑膜細(xì)胞中VEGFmRNA陽(yáng)性表達(dá)常見(jiàn)，而后者少見(jiàn)。前者的細(xì)胞凋亡程度卻顯著減少(MIOD：168.371±12.866 vs 959.226±80.886.p<0.01：MSA：180.210±8.206 vs 1890.510±159.139，p<0.01)。 2.南蛇藤與來(lái)氟米特均能顯著降低NOD/SCID-HuRAg模型中的滑膜增生。(分別為2.000±0.756，2.250±0.886 vs3.625±0.51

12、7，p<0.01)、軟骨侵蝕(1.687±0.799，2.000±1.362 vs 3.750±0.535，p<0.01)和軟骨降解(1.875 ±0.835，2.125±0.835 vs 3.635±0.744，p<0.01)的積分，并顯著降低血清TNF-a含量(0.840±0.088，0.803±0.068 vs 0.993±0.114，p<0.01，ng/ml)。無(wú)論MIOD(350.595±253.354， 354.002±26

13、5.903 vs 75.138±44.793，p<0.05)還是MSA(932.324±715.187，892.480±563.899 vs 191.331±115.550，p<0.05)，均顯示二種藥物均顯著促進(jìn)了滑膜細(xì)胞凋亡。而南蛇藤醇提物還能顯著下調(diào)滑膜TNF-a mRNA的表達(dá)，來(lái)氟米特組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.滑膜和軟骨在BNX鼠體內(nèi)生長(zhǎng)良好。 Etanercept組中滑膜增生(2.100±0.994 vs 3.70

14、0±0.483，p<0.01)、軟骨侵蝕(1.550±0.726 vs 3.750±0.535，p<0.05)、軟骨降解(1.300±0.823 vs 3.635±0.744，p<0.01)積分以及血清TNF-a含量(0.596±0.095 vs 0.694±0.112，p<0.05，ng/m1)均顯著降低；同時(shí)，Etanercept還能顯著下調(diào)滑膜細(xì)胞的TNF-a mRNA的表達(dá)(MIOD：35.336±32.277 vs162.66

15、4±142.269，P<0.05；MSA：127.185±117.824 vs 582.376±530.321，P<0.05)和VEGF mRNA(MIOD：75.580±34.115 vs 211.944±114.096，P<0.01：MSA：201.530±82.974 vsS 552.965±413.223，P<0.05)。但對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡的影響則無(wú)顯著差異。 四.結(jié)論 人RA滑膜和正常關(guān)節(jié)軟骨在NOD/SCID鼠

16、和BNX鼠體內(nèi)均能良好生長(zhǎng)。移植后RA滑膜細(xì)胞繼續(xù)保持增生和侵蝕能力，且繼續(xù)高表達(dá)TNF-a和VEGF，而細(xì)胞凋亡則明顯受抑。南蛇藤醇提物能顯著抑制RA的滑膜增生，減輕滑膜對(duì)軟骨侵蝕和軟骨細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨降解，其作用機(jī)制包括抑制RA滑膜組織的TNF-a的產(chǎn)生和促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡。其作用效果與來(lái)氟米特相似，但在抑制滑膜TNF-a表達(dá)方面南蛇藤?gòu)?qiáng)于來(lái)氟米特。Etanercept也具有抑制RA滑膜增生和軟骨侵蝕及降解作用，其作用機(jī)制除了中和滑膜組