人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞-軟骨-SCID鼠嵌合體模型的研制.pdf

1、研究背景與目的:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥導(dǎo)致軟骨侵蝕破壞為病理中心的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為對(duì)稱性、慢性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎，并可累及多個(gè)臟器。關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，形成血管翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。RA的發(fā)病率在我國(guó)約為0.4％，全球?yàn)?.5％～1.0％，多發(fā)于中青年，該病致殘率很高

2、，嚴(yán)重影響患者的工作和生存質(zhì)量。但是RA的病因與發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。RA動(dòng)物模型是研究RA病因和發(fā)病機(jī)制的最為有效的途徑之一。
　　 傳統(tǒng)的RA動(dòng)物模型包括兩大類，一是誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎如佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)等，一是自發(fā)性關(guān)節(jié)炎主要是指基因修飾關(guān)節(jié)炎小鼠，包括K/BXN小鼠、NZB/NZW小鼠。這些RA動(dòng)物模型

3、雖可模擬出外周多關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出關(guān)節(jié)的紅腫、疼痛，病理變化也可表現(xiàn)出關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等特點(diǎn)，與人RA在臨床表現(xiàn)、病理、免疫有著相似或相近的特點(diǎn)。但是關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)隨著注射點(diǎn)的不同炎癥局限，具有自限性，而且在血清中很難檢測(cè)到RF、CCP抗體、炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等RA血清學(xué)指標(biāo)。自發(fā)性動(dòng)物模型除上述外周關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)外，雖可在血清中檢測(cè)出RF、CCP抗體、MMP3等指標(biāo)，但是造價(jià)昂貴，臨床應(yīng)用受限。由于R

4、A病因病機(jī)復(fù)雜且多變，這些模型只是側(cè)重于RA炎癥反應(yīng)這一特點(diǎn)，僅僅反映出是由T、B細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)這一過(guò)程，并沒(méi)有完全反應(yīng)慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)、滑膜炎癥并增生、關(guān)節(jié)侵蝕破壞等中心病理特征，因此這些具有一定的局限性，制約了對(duì)RA病因病機(jī)的研究。
　　 隨著對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblast，RASF)的深入研究，發(fā)現(xiàn) RASF在 RA的發(fā)病中不在作為一個(gè)“旁觀者”

5、，而是一個(gè)“主動(dòng)參與者”。在RA中，RASF一直處于慢性活化狀態(tài)，細(xì)胞本身出現(xiàn)一系列轉(zhuǎn)化特性，生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制障礙，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)“類腫瘤樣生長(zhǎng)”，自身過(guò)度增殖，且不依賴于“T細(xì)胞介導(dǎo)”這一途徑就可分泌多種趨化因子、炎癥因子、MMP類、組織蛋白酶類，引起慢性持續(xù)性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕破壞，在RA滑膜增生，關(guān)節(jié)炎癥，軟骨的侵蝕破壞方面起著關(guān)鍵作用。
　　 上世紀(jì)90年代開(kāi)始，Geiler首次將人RA滑膜組織與人正常軟骨聯(lián)合移植入SCID

6、小鼠的腎囊中，發(fā)現(xiàn)移植的滑膜出現(xiàn)增生，并侵蝕人的軟骨，在侵蝕處檢測(cè)到滑膜成纖維樣細(xì)胞增生活躍，大量表達(dá)基質(zhì)降解酶的mRNA。成功建立一種新型的人源化動(dòng)物模型—SCID—HuRAg鼠嵌合體模型。隨后造模方式、移植材料得到不斷的改進(jìn)。移植物可以是滑膜組織，體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞，也可以是關(guān)節(jié)液;移植方式可以是滑膜和軟骨共同移植，滑膜細(xì)胞和軟骨共同移植，也可以是單獨(dú)的滑膜細(xì)胞為移植物;移植部位多樣，可以是腎囊、腹腔、皮下、膝關(guān)節(jié)等。隨著SCID—

7、HuRAg鼠動(dòng)物模型的建立和不斷的改進(jìn)，不僅證實(shí)RASF的關(guān)鍵作用，完善了RA的發(fā)病機(jī)制，而且在藥理研究、新藥開(kāi)發(fā)方面發(fā)揮了不可替代的作用。由于SCID—HuRAg鼠嵌合體模型能完全不受T、B細(xì)胞的影響，在無(wú)免疫炎癥的環(huán)境下，表現(xiàn)出的病變過(guò)程與人RA滑膜、軟骨病變過(guò)程幾乎一致，且可在血清中檢測(cè)到CCP抗體、IL-6、TNF-α等因子，成為RA動(dòng)物模型的主流。
　　 但是在國(guó)內(nèi)，對(duì)人源化的SCID—HuRAg鼠動(dòng)物模型的研究起步很

8、晚，僅有報(bào)道將滑膜組織和人的正常軟骨植入SCID鼠的耳廓或皮下[8、9]，觀察到滑膜組織的增生和對(duì)軟骨的侵蝕破壞。而我國(guó)中藥資源豐富，為了更有效的篩選有效的中草藥，在吸取前人的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們將制作人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞—軟骨—SCID鼠嵌合體模型，初步探討RASF在SCID鼠體內(nèi)的作用機(jī)制，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)的空白。
　　 研究方法:
　　 （一）建立人RASF/OASF體外培養(yǎng)與鑒定
　　 1、采用兩種酶類（Ⅱ型

9、膠原酶和0.25％胰酶）聯(lián)合消化的方法，消化、分離培養(yǎng)、傳代、凍存人RASF/OASF，建立培養(yǎng)和保存體系。
　　 2、采用自然純化法和反復(fù)貼壁法純化滑膜成纖維細(xì)胞，用vimentin抗體和CD68抗體鑒定滑膜成纖維細(xì)胞。
　　 3、采用5—溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，5-Brdu)標(biāo)記方法標(biāo)記滑膜細(xì)胞。將濃度為10mmol/1的5-Brdu液經(jīng)完全培養(yǎng)基稀釋后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液定

10、容至10ml，使5-Brdu的終濃度為10umol/1，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體鑒定細(xì)胞標(biāo)記效果。
　　 （二）模型移植方法的建立
　　 1、移植細(xì)胞的選擇
　　 選擇第四代活力良好、經(jīng)純化的、做好5-Brdu標(biāo)記的滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)消化、離心、重懸，細(xì)胞密度調(diào)整為2×105，做為移植細(xì)胞。
　　 2、人正常軟骨的選擇
　　 軟骨來(lái)源為一例因糖尿病壞疽行而行左踝關(guān)節(jié)截肢術(shù)的踝

11、關(guān)節(jié)軟骨，消毒、逐層分離皮膚、肌肉，暴露踝關(guān)節(jié)，剔除關(guān)節(jié)軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨修剪成大小約0.5cm×0.5cm大小，在離體3h內(nèi)植SCID鼠體內(nèi)。
　　 3、無(wú)菌明膠海綿
　　 將無(wú)菌明膠海綿修飾成約0.8cm×0.8cm大小的小塊，備用。
　　 4、模型制作
　　 將SCID鼠隨機(jī)分為兩組，RASF組和OASF組，麻醉、備皮、消毒，在小鼠背部脊正中線外右側(cè)約1cm處做約1～1.5cm長(zhǎng)的縱行切口，將修剪好的

12、軟骨小塊處入皮下，放平。同樣將修剪好的無(wú)菌明膠海綿置于軟骨面上，將500ul細(xì)胞液注入放置好的明膠海綿內(nèi)，使海綿充分濕潤(rùn)，縫合切口皮膚并消毒。RASF組注射細(xì)胞為RASF，OASF組注射細(xì)胞為OASF。
　　 （三）模型評(píng)價(jià)方法
　　 1、制作移植物石蠟H&E切片，觀察評(píng)價(jià)滑膜成纖維細(xì)胞對(duì)移植物軟骨的侵蝕降解程度，做出組織學(xué)評(píng)分，給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 2、制作鼠雙膝關(guān)節(jié)石蠟 H&E切片，觀察鼠膝關(guān)節(jié)滑膜增生情況

13、和膝關(guān)節(jié)軟骨侵蝕破壞程度，做出組織學(xué)評(píng)分，給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 3、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)滑膜成纖維細(xì)胞5-Brdu抗體和vimentin抗體，觀察滑膜成纖維細(xì)胞在SCID鼠體內(nèi)活動(dòng)情況。
　　 4、利用IL-6、MMP3酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測(cè)兩組模型鼠血清中人IL-6、MMP3的含量。
　　 研究結(jié)果:
　　 （一）滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記
　　 通過(guò)酶消化法，獲得大量的滑膜細(xì)胞，利用自

14、然純化發(fā)和反復(fù)貼壁法，在細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三時(shí)，行細(xì)胞形態(tài)鑒定，滑膜成纖維細(xì)胞呈vimentin陽(yáng)性，CD68陰性，在熒光顯微鏡下觀察，滑膜成纖維細(xì)胞呈綠色熒光狀，細(xì)胞形態(tài)多樣，以紡錘形為主，細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清楚。細(xì)胞呈渦狀生長(zhǎng)，活力良好。滑膜成纖維細(xì)胞的純化率高。檢測(cè)5-Brdu標(biāo)記，在顯微鏡下觀察，標(biāo)記好5-Brdu的滑膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色著色，細(xì)胞標(biāo)記率高。
　　 （二）模型鼠評(píng)價(jià)結(jié)果
　　

15、 1、移植物組織學(xué)評(píng)價(jià)
　　 鏡下觀察移植物內(nèi)滑膜成纖維細(xì)胞在皮下和軟骨周圍存活并增生，侵蝕軟骨，侵蝕點(diǎn)多在軟骨邊緣，軟骨表面很少見(jiàn)到侵蝕點(diǎn)。軟骨邊緣的軟骨細(xì)胞介導(dǎo)周圍軟骨降解明顯，軟骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞核周圍的暈輪空泡擴(kuò)大，邊緣失去銳利且較毛糙不光整。RASF組移植物的軟骨侵蝕程度(0.643±0.690 vs0.333±0.500)和軟骨降解程度（2.286±0.756 vsl.667±1.000）較OASF組

16、有增高趨勢(shì)。
　　 2、膝關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)價(jià)
　　 鏡下觀察小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜有不同程度的增生，在鼠膝關(guān)節(jié)腔里也可看到增生的滑膜，有新生血管形成，有些血管與增生的滑膜細(xì)胞形成纖維結(jié)節(jié)。增生的滑膜可侵蝕軟骨，嚴(yán)重者可侵犯至骨質(zhì)。RASF組鼠膝關(guān)節(jié)的滑膜增生程度(3.091±0.831 vs1.667±0.985 p＜0.01)和軟骨侵蝕程度（1.636±1.748 vs0.583±1.379 p＜0.05）均顯著高于OASF組。<

17、br>　　 3、滑膜成纖維細(xì)胞在鼠體內(nèi)活動(dòng)途徑
　　 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在SCID鼠皮下、移植軟骨處、鼠膝關(guān)節(jié)滑膜及骨髓中檢測(cè)出Brdu及vimentin陽(yáng)性的SFs，證實(shí)滑膜成纖維細(xì)胞可經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)行長(zhǎng)距離遷移。
　　 4、血清學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)
　　 我們僅在RASFs組鼠血清中檢測(cè)出一例人的IL-6，其含量為55pg/ml，OASFs組鼠血清未檢測(cè)出IL-6。而MMP3的血清含量OA組為(39.50±17.35)

18、pg/ml，在RASFs組僅有一只小鼠血清檢測(cè)出MMP3，含量為59 pg/ml。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功建立人RASF和OASF體外培養(yǎng)和保存體系;
　　 2、成功建立人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞—軟骨—SCID鼠嵌合體模型，初步探討滑膜成纖維細(xì)胞在SCID鼠體內(nèi)的作用機(jī)制，即滑膜成纖維細(xì)胞在體內(nèi)可分泌多種細(xì)胞因子，造成移植軟骨降解，并可經(jīng)血液循環(huán)，遷移至鼠膝關(guān)節(jié)腔，引起膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥，滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨