類風濕關節(jié)炎患者關節(jié)成纖維樣滑膜細胞蛋白質組的研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性關節(jié)滑膜炎為主要特點的自身免疫性疾病,目前認為抗原驅動及T細胞介導是RA發(fā)病的關鍵因素,有關其確切發(fā)病機制仍未完全明確,因而尚無滿意的診斷方法和治療藥物。近年來蛋白質組學技術的飛速發(fā)展,為研究RA的發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)早期診斷的分子標記物提供了科學依據(jù)。本實驗用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)和基質輔助激光解析

2、電離飛行時間質譜技術(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析RA患者與外科創(chuàng)傷患者關節(jié)成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)蛋白質表達差異,為尋找RA關節(jié)滑膜特異性表達蛋白、RA的早期診斷、藥物靶點篩選及發(fā)病機制探討提供可靠的實驗研究依據(jù)。
　　

3、 由于健康人滑膜組織難以獲取,本實驗中采用外科創(chuàng)傷患者作為對照組。取自經(jīng)手術切除的RA患者和外科創(chuàng)傷患者的滑膜組織,采用膠原酶和胰酶結合消化法分離培養(yǎng)FLS,免疫細胞化學鑒定FLS內波形蛋白(vimentin)的表達。選用4～7代的FLS,裂解細胞獲得細胞總蛋白,Bradford測定蛋白質濃度,利用2-DE分離RA患者及對照組FLS總蛋白質,凝膠經(jīng)銀染顯色和Image Master圖像軟件分析凝膠圖譜,從凝膠中切取差異蛋白質斑點,MA

4、LDI-TOF-MS分析得到相應的肽質量指紋圖譜(peptide mass fmgerprinring,PMF),用Mascot查詢軟件搜索數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白,初步分析某些蛋白質在FLS中的功能,并對部分差異蛋白質點進行Western blot驗證。
　　 光學顯微鏡下可見,培養(yǎng)的FLS呈梭形或柱形,兩極胞突細長,末端多與鄰近細胞連接并交織成網(wǎng)狀,呈現(xiàn)極向排列或渦旋生長。細胞核呈卵圓形,位于細胞中央,核仁明顯。免疫細胞化學染色結果顯

5、示FLS胞漿內呈vimentin陽性反應,陽性細胞率達99％以上,符合成纖維細胞的特征。
　　 RA患者和對照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出1633、1603個蛋白質點。對二者相互匹配的蛋白質點進行差異分析,以差異量大于3倍的表達量為準,初步篩選出92個差異表達的蛋白質斑點,其中RA中表達上調和高豐度表達的蛋白有33個,下調表達的59個。挑選RA上調表達的33個點進行膠內原位酶解及MALDI-TOF-MS分析,成功鑒定出30個

6、點,其中有6個蛋白質分子,如葡萄糖調節(jié)蛋白78(78 kDaglucose-regulated protein,BiP)、α-烯醇化酶(α-enolase,NNE)、核纖層蛋白(lamins-A/C,IMN1)、過氧化物還原酶1(peroxiredoxinl,PRDX1)、谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GSTM2)、蛋白質二硫化物異構酶A3前體(proteindisulfide-isomeras

7、e A3 precursor,ERp60)等己有文獻報道在RA中呈現(xiàn)特異性表達,其中BiP是RA已知的自身抗原,另有24個是本研究新發(fā)現(xiàn)的具有潛在應用價值的分子標記物。根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的信息,對鑒定的蛋白質按功能進行初步分類,主要涉及:①參與物質代謝或能量產生的生物酶類,如腫瘤型丙酮酸激酶(M2-pyruvatekinase,M2-PK),α-enolase;②細胞信號轉導蛋白,如膜聯(lián)蛋白(annexin A11,ANX11);③細胞結構

8、蛋白,如lamin-A/C,核基質蛋白(ruvB-like1,NMP238);④分子伴侶,如葡萄糖調節(jié)蛋白(stress-70 protein,mitochonddal precursor,GRP75),αB-晶體蛋白(α-crystallin B chain,HspB5);⑤假定或未知蛋白,如PSME4,SELENBP1。
　　 為進一步證實差異蛋白在RA中的特異表達,我們選擇4個差異蛋白α-enolase、lamin—A/C