鈣網(wǎng)織蛋白促進類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞存活和新生血管形成的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是免疫介導的以慢性、侵襲性外周關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的疾病。RA的主要病理特征是關(guān)節(jié)滑膜炎和侵蝕性血管翳的形成，最終導致關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)功能障礙。RA的病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。有研究報道，鈣網(wǎng)織蛋白（Calreticulin,CRT）可能參與了RA的發(fā)病機制。本課題組前期的研究結(jié)果表明，CRT在 RA患者體內(nèi)表達升高，且血清CRT水平與RA患者疾病活

2、動度呈顯著正相關(guān)。此外，既往研究和我們前期工作還顯示CRT可能通過抑制T細胞凋亡參與RA的發(fā)病。本課題在以往研究的基礎(chǔ)上，進一步探討CRT通過促進RA成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）存活和新生血管形成參與RA滑膜炎癥的發(fā)病機制,為揭示RA的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測106例 RA患者、75例骨性關(guān)節(jié)炎

3、（osteoarthritis，OA）患者及80例健康對照（healthy control，HC）血清中鈣網(wǎng)織蛋白（CRT）的含量，同時檢測25例RA和22例OA患者關(guān)節(jié)滑膜液中CRT的含量。
　　2.采用免疫組織化學技術(shù)檢測RA和OA患者滑膜組織中CRT以及抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1的表達，并進一步分析RA滑膜組織中CRT表達水平與Bcl-XL和Mcl-1表達水平之間的相關(guān)性。
　　3.采用膠原酶消化法分離RA和O

4、A患者滑膜組織中的成纖維樣滑膜細胞（FLS）并進行體外培養(yǎng)。應(yīng)用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、Western Blot以及細胞免疫熒光等技術(shù)，檢測RA和OA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表達。
　　4. RA和OA FLS體外分離培養(yǎng)，加入不同濃度的人重組CRT，qRT-PCR和Western Blot分別檢測FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表達。
　　5

5、.評估PI3K/Akt和STAT3信號通路在CRT介導RA FLS中的Bcl-XL和Mcl-1表達上調(diào)中的作用。RA FLS體外培養(yǎng)，PI3K/Akt或STAT3信號通路抑制劑預孵育，然后加入人重組CRT，qRT-PCR和Western Blot檢測Bcl-XL和Mcl-1的表達。Western Blot分析CRT刺激下PI3K/Akt和STAT3通路的主要信號分子在RA FLS中的激活和表達。
　　6.采用MTT試驗檢測CRT對

6、RA FLS增殖的影響；流式細胞術(shù)凋亡細胞染色檢測CRT對FasL誘導的RA FLS凋亡的影響。
　　7.采集新生兒的臍帶標本，膠原酶臍帶灌注消化法分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）并體外培養(yǎng)。加入人重組CRT，檢測HUVECs產(chǎn)生NO的量，qRT-PCR和Western Blot檢測CRT刺激下HUVECs中PI3K/Akt-eNOS的激活和表達。8.分別采用 MTT試驗、細胞劃痕試驗以及構(gòu)建體外血管生成的三維模型檢測PI3K

7、/Akt-eNOS-NO信號通路在CRT介導的HUVECs增殖、遷移及管腔形成中的作用。
　　結(jié)果：
　　1. RA患者血清中CRT含量[(6.4±3.1) ng/ml]顯著高于OA患者[(3.7±0.9) ng/ml]及HC[(3.4±1.0) ng/ml](P<0.001)，而OA患者與HC組之間CRT濃度差異無統(tǒng)計學意義(P=0.376)。RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中CRT含量[(6.9±3.4) ng/ml]明顯高于OA患者

8、[(3.9±0.7) ng/ml](P<0.001)。RA患者血清與關(guān)節(jié)滑膜液中CRT含量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.478)。
　　2.免疫組織化學結(jié)果顯示，RA患者滑膜組織中CRT、Bcl-XL和Mcl-1均呈高表達，主要位于滑膜組織的襯里層和襯里下層、血管內(nèi)皮細胞、炎性細胞及血管周圍，而OA滑膜組織中CRT、Bcl-XL和Mcl-1僅見少量表達。相關(guān)性分析顯示，RA滑膜組織中CRT表達水平與Bcl-XL和Mcl-1表達水平之間

9、呈正相關(guān)（r=0.5735，P=0.0404；r=0.6200，P=0.0238）。
　　3. QRT-PCR、Western Blot以及細胞免疫熒光檢測結(jié)果均表明，RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的表達水平明顯高于OA FLS。
　　4.不同濃度的CRT作用后，RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1的mRNA表達水平和蛋白表達水平均升高，且隨著CRT濃度的增加，二者表達水平的升高呈濃度依賴性。CRT作用后OA FL

10、S中Bcl-XL和Mcl-1的mRNA表達水平和蛋白表達水平?jīng)]有明顯的改變。
　　5.加入PI3K/Akt或STAT3信號通路抑制劑后，CRT使RA FLS中Bcl-XL和Mcl-1表達上調(diào)的作用被抑制。在CRT的作用下，RA FLS中PI3K/Akt和STAT3信號通路被激活，p-Akt和p-STAT3表達水平明顯升高。
　　6. FasL處理組RA FLS發(fā)生了明顯的凋亡，細胞凋亡百分比為22.67％±6.82%，CRT

11、（10、100ng/ml）預孵育后，F(xiàn)asL誘導細胞凋亡百分比明顯降低，分別為8.59%±4.36%和5.97%±3.82%；CRT沒有明顯的促進RA FLS增殖的作用。7.不同濃度的CRT作用后，HUVECs產(chǎn)生NO的量呈濃度依賴性升高。在CRT作用下，HUVECs中p-eNOS被激活，p-eNOS的表達水平明顯增加。加入PI3K/Akt抑制劑后，CRT介導的p-eNOS表達水平升高被抑制。CRT對HUVECs中總eNOS的mRNA和

12、蛋白表達沒有明顯的作用。
　　8. MTT試驗、細胞劃痕試驗及體外血管生成三維模型的檢測結(jié)果顯示，CRT具有顯著促進HUVECs增殖、遷移及管腔形成的作用，加入eNOS的抑制劑明顯抑制了CRT促進HUVECs增殖、遷移和管腔形成的作用。
　　結(jié)論：
　　1. CRT在RA患者的血清、滑膜液以及滑膜組織中表達均升高，CRT可能通過激活PI3K/Akt和STAT3信號通路使RA FLS中抗凋亡分子Bcl-XL和Mcl-1表