海藻多糖對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為主的自身免疫性疾病，可累及全身多個(gè)關(guān)節(jié)尤其是雙手、腕、肘、肩、膝、踝和足關(guān)節(jié)，臨床表現(xiàn)包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，最終可造成關(guān)節(jié)破壞、畸形和功能喪失。目前RA無根治的方法，其中非甾類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素主要是控制癥狀；改善病情藥可延緩關(guān)節(jié)破壞，控制病情，但起效慢，毒副作用大；生物制劑價(jià)格昂貴，且有潛在的感染、脫髓鞘病變、致

2、腫瘤危險(xiǎn)，且僅對(duì)部分難治性RA有效。因此，開發(fā)新的更安全、有效的藥物仍是目前RA研究的主要方向。
　　 RA的基本病理特征為滑膜炎及血管翳形成，滑膜炎主要表現(xiàn)為滑膜細(xì)胞數(shù)量異常增多，襯里層由原來的1～3層增生到5～6層甚至更多，其中的成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)是介導(dǎo)RA滑膜炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞?；罨腇LS可分泌多種炎癥介質(zhì)、促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、粘附分子和

3、生長(zhǎng)因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和持續(xù)，促進(jìn)新生血管及血管翳的形成，還可產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等多種細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，引起關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和關(guān)節(jié)周圍的軟組織破壞。
　　 RA-FLS在慢性炎癥過程中被激活后，出現(xiàn)細(xì)胞表型的顯著改變，具有不完全轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性，即使脫離炎癥環(huán)境仍持續(xù)活化，增殖能力升高，逃脫接觸抑制，呈現(xiàn)腫瘤樣增殖，并具有侵襲能力。研究表明RA-FLS在炎癥滑膜

4、中過度增殖的機(jī)制包括：①增殖活躍：RA患者關(guān)節(jié)液中存在的多種自分泌因子以及體外培養(yǎng)的RA-FLS合成并釋放的炎癥細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子可導(dǎo)致RA-FLS增殖和活化；②凋亡減少：RA-FLS中存在凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)，如Bcl-2、Fas、P53等，體外培養(yǎng)的RA-FLS中Fas mRNA表達(dá)較高，提示其可能處于一種激活狀態(tài)；RA-FLS中Bcl-2 mRNA過量表達(dá)，可能抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；另外，RA-FLS表達(dá)阻斷凋亡的多種因子，

5、如IL-15、FLIP、centrin等；③前體細(xì)胞的補(bǔ)充：循環(huán)中的間質(zhì)前體細(xì)胞具有多向分化能力，可被功能性地募集到滑膜層，向FLS分化和成熟；④細(xì)胞衰老的減緩：RA病人的滑膜細(xì)胞中能夠檢測(cè)到明顯的端粒酶活性，提示細(xì)胞衰老的延緩和減少可能是促進(jìn)RA-FLS增殖的機(jī)制之一。因此抑制RA-FLS的增殖、誘導(dǎo)其凋亡可能成為治療RA的重要靶向。
　　 海藻多糖由海藻經(jīng)過提純純化等工藝獲取，是一類多組分混合物，由不同的單糖基通過糖苷鍵相連

6、而成，包含海藻細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的各種高分子碳水化合物，呈水溶性。海藻多糖具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗血管生成及增強(qiáng)免疫力等，其毒副作用極小。海藻多糖抗腫瘤的作用是通過多種途徑實(shí)現(xiàn)的：①增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞，間接抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞；②影響腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期，進(jìn)而影響其分裂、增殖、生長(zhǎng)；③抗血管效應(yīng)：抑制血管生成，影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；④誘導(dǎo)抑癌基因p53的表達(dá)增加，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化與凋亡；⑤促進(jìn)b

7、ax基因的表達(dá)，抑制bcl-2基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；⑥影響凋亡信號(hào)通路中的IGF-IR、PI3K/Akt、ERK等信號(hào)分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 國(guó)內(nèi)有研究者在臨床應(yīng)用以羊棲菜入藥的古方加減海藻玉壺丸治療RA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療60d后，總有效率為96％。另有研究顯示口服含有褐藻綱、綠藻綱和(或)紅藻綱的提取物可預(yù)防和改善關(guān)節(jié)炎。因此，進(jìn)一步研究海藻多糖治療RA的機(jī)制可為開辟RA治療新藥提供理論依據(jù)。
　　 目前國(guó)內(nèi)

8、外尚無海藻多糖對(duì)RA-FLS凋亡影響的相關(guān)研究和報(bào)道。本研究通過盲式細(xì)針滑膜活檢術(shù)獲取RA滑膜組織，體外分離、培養(yǎng)、純化FLS，體外采用海藻多糖干預(yù)RA-FLS，探討海藻多糖對(duì)RA-FLS凋亡的影響及機(jī)制。
　　 第一章、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　 目的:
　　 以改良組織塊法分離、培養(yǎng)、純化活檢滑膜組織FLS，了解RA-FLS的生長(zhǎng)特性，為進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 材料和方法：

9、
　　 臨床確診的RA活動(dòng)期患者，行膝關(guān)節(jié)盲式細(xì)針滑膜活檢術(shù)獲取滑膜組織，采用改良組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行RA-FLS的原代培養(yǎng)，并通過光鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法進(jìn)行鑒定，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)比色法檢測(cè)RA-FLS的細(xì)胞增殖，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示；多

10、組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。顯著性水準(zhǔn)為0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.RA-FLS的原代培養(yǎng)采用改良組織塊法1～2 d后見長(zhǎng)梭型FLS從組織塊邊緣游走生長(zhǎng)，并逐漸增多呈放射狀，一周后細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，約2～3 w長(zhǎng)滿瓶底的70％～80％。
　　 2.RA-FLS計(jì)數(shù)及活性鑒定對(duì)RA-FLS第3～

11、5代細(xì)胞行臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，RA-FLS長(zhǎng)滿25 cm2培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞總數(shù)為(8.30±1.65)×105/瓶，活細(xì)胞百分率均＞95％。
　　 3.RA-FLS的鑒定倒置相差顯微鏡下觀察可見RA-FLS呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰，細(xì)胞周圍可見分泌物聚集。透射電鏡下觀察可見FLS核染色質(zhì)較疏松，呈細(xì)顆粒狀分布在核周圍，核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿突起長(zhǎng)而粗，胞漿中往往缺乏高爾基復(fù)合體，可見少量小泡和囊泡。波形

12、蛋白(Vimentin)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)、CD68免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示第3～5代RA-FLS Vimentin、CK染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3～5代RA-FLS CD55+細(xì)胞百分率為(95.34±2.47)％。
　　 4.CCK-8比色法顯示RA-FLS倍增時(shí)間約7 d。
　　 小結(jié)：
　　 采用改良組織塊法進(jìn)行RA-FLS體外培養(yǎng)成功率

13、高，細(xì)胞游出時(shí)間較早，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，到達(dá)傳代時(shí)間較短。當(dāng)傳代至第3～5代時(shí)，RA-FLS的純度高，增殖活性高，生長(zhǎng)狀態(tài)好，可用于進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　 第二章、海藻多糖對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制
　　 目的：
　　 了解海藻多糖能否抑制體外培養(yǎng)的RA-FLS增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并初步探討凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.CCK-8比色法檢測(cè)不同濃度(0、

14、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5 d)后對(duì)RA-FLS增殖的影響。
　　 2.Hochest33258染色法檢測(cè)不同濃度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)不同時(shí)間(0、3、4、5 d)后對(duì)RA-FLS凋亡的影響。
　　 3.TUNEL染色法檢測(cè)不同濃度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)不同時(shí)間(0、3、4、5 d)后對(duì)RA-FLS凋亡的影響并計(jì)算

15、凋亡率。
　　 4.Western Blot檢測(cè)不同濃度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)于4d后對(duì)RA-FLS caspase-3、bax、bcl-2蛋白表達(dá)的影響。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)

16、，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。顯著性水準(zhǔn)為0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.CCK-8比色法結(jié)果顯示海藻多糖可呈劑量和時(shí)間依賴性抑制RA-FLS的增殖。不同濃度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)RA-FLS4 d后，細(xì)胞增殖抑制率分別為12.72％、24.22％、35.40％(F=689.278，p＜0.001)；20 mg/ml的海藻多糖干預(yù)RA-FLS不同時(shí)間(3、4、5 d)后，細(xì)

17、胞增殖抑制率分別為10.92％、24.22％、37.00％(F=96.114，p＜0.001)。
　　 2.Hochest33258染色法結(jié)果顯示不同濃度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)不同時(shí)間(3、4、5 d)后均可誘導(dǎo)RA-FLS凋亡。
　　 3.TUNEL染色法結(jié)果顯示海藻多糖可呈劑量和時(shí)間依賴性促進(jìn)RA-FLS的凋亡。
　　 4.Western Blot結(jié)果顯示海藻多糖可呈劑量依賴性影響RA

18、-FLS caspase-3、bax、bcl-2蛋白的表達(dá)。不同濃度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干預(yù)于4 d后可引起RA-FLS caspase-3蛋白表達(dá)增高、bax蛋白表達(dá)增高、bcl-2蛋白表達(dá)降低(F=101.986、44.674、67.295，p＜0.001、0.001、0.001)。
　　 小結(jié)
　　 海藻多糖在體外能抑制RA-FLS增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且增殖抑制作用及凋亡誘導(dǎo)作用呈劑量和時(shí)間依賴