IL-22抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，疾病最終階段伴有關(guān)節(jié)進(jìn)行性損傷和殘疾，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期有效的治療，可以緩解患者癥狀，延緩疾病進(jìn)展，降低RA的致殘率，大大提高患者的生活質(zhì)量。生物制劑從20世紀(jì)90年代中期已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床，對RA的治療藥物包括TNF因子拮抗劑，IL-1受體拮抗劑，IL-6受體拮抗劑類等。雖然生物制劑的出現(xiàn)為RA的治療帶來了革新，但RA具

2、有異質(zhì)性，仍有很大部分患者對現(xiàn)有的RA治療方法不敏感。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究，著眼于在滑膜炎中起重要作用的細(xì)胞因子，以期為RA治療尋找新的靶點(diǎn)。細(xì)胞因子IL-22是具有179個(gè)氨基酸長度的蛋白質(zhì)，為IL-10家族中的成員之一。對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)IL-22具有促進(jìn)腫瘤增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。RA的滑膜組織具有腫瘤組織樣特性，異常增殖，抑制凋亡，侵蝕性等。對RA的臨床研究發(fā)現(xiàn)，IL-22與RA發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，

3、具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞凋亡即程序性死亡，是細(xì)胞在活體組織中被完全清除的過程。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)有外源性通路和內(nèi)源性通路，當(dāng)細(xì)胞表面的凋亡相關(guān)受體，如Fas與相應(yīng)的配體結(jié)合，啟動(dòng)凋亡為細(xì)胞外源性通路，當(dāng)Bcl-2家族前凋亡蛋白表達(dá)引起線粒體外膜通透性增加啟動(dòng)凋亡為細(xì)胞內(nèi)源性通路。兩個(gè)通路共同激活半胱天冬酶蛋白酶家族(Caspase家族)，最終引起細(xì)胞凋亡。目前IL-22對滑膜細(xì)胞凋亡的影響報(bào)道尚少。本實(shí)驗(yàn)主要研究IL-22對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑

4、膜成纖維細(xì)胞(rheumatic arthritis fibroblast-likesynoviocytes，RA-FLS)凋亡的影響及其機(jī)制，為RA治療提供新的靶點(diǎn)。
　　研究方法:滑膜組織均來自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2015.1～2015.7行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者。對滑膜組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得RA-FLS。WB(westernblotting)方法檢測IL-22R1、pSTAT3-Y705，pSTAT3-S727，STA

5、T3、Bcl-XL、 Bcl-2蛋白表達(dá)。MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide))法檢測細(xì)胞活性，AV/PI(annexin V/propidium iodide)染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)。時(shí)實(shí)熒光PCR(real-time PCR)法檢測Bcl-XL和Bcl-2 mRNA的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、RA-FLS表達(dá)IL-22R1。

6、用WB方法檢測RA-FLS中IL-22R1的表達(dá)，結(jié)果顯示，RA-FLS細(xì)胞與陽性對照細(xì)胞HepG2比較，IL-22R1的表達(dá)無差異。結(jié)果表明RA-FLS高表達(dá)IL-22R1。2、IL-22促進(jìn)SNP誘導(dǎo)的RA-FLS增殖、抑制凋亡。用SNP誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡，用MTT法檢測加入不同濃度的IL-22后RA-FLS細(xì)胞活性變化，用AV/PI檢測細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)變化。結(jié)果顯示不同劑量的IL-22作用，1ng/ml IL-22對SNP誘導(dǎo)

7、的RA-FLS細(xì)胞活性影響不明顯，10 ng/ml、100ng/ml IL-22能增加細(xì)胞活性，抑制SNP誘導(dǎo)的RA-FLS凋亡的發(fā)生。IL-22(10ng/ml)+SNP組較SNP組，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯減少（51.11±1.23 vs67.87±4.75，p＜0.05），IL-22(100ng/ml)+SNP組較SNP組，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)減少更明顯（34.25±1.98 vs67.87±4.75，p＜0.01）。3、IL-22通過STA

8、T3通路抑制RA-FLS細(xì)胞凋亡。首先，WB法檢測pSTAT3-Y705和pSTAT3-S727表達(dá)，結(jié)果顯示IL-22作用30分鐘后，RA-FLS中pSTAT3-Y705和pSTAT3-S727表達(dá)就明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明IL-22可以激活STAT3通路。其次，加入STAT3通路特異性抑制劑HO3867或STA21，AV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示SNP+IL-22+HO3867組較SNP+IL-22組（48.91

9、±2.99 vs31.41±4.55，p＜0.05）、SNP+IL-22+STA21組較SNP+IL-22組（61.97±7.09 vs31.41±4.55，p＜0.05），細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)均明顯增加，HO3867、STA21抑制了IL-22對RA-FLS的保護(hù)作用。4、IL-22激活STAT3通路下游靶基因Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)。用WB法和rt-PCR檢測STAT3下游靶基因Bcl-XL、 Bcl-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)。WB結(jié)果顯示SNP+

10、IL-22組較SNP組Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)明顯增加，加入STAT3抑制劑的SNP+IL-22+HO3867組、SNP+IL-22+STA21組較SNP+IL-22組Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)均明顯減低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); real-time PCR測得Bcl-2、Bcl-XLmRNA水平變化與WB測得的Bcl-2、Bcl-XL蛋白水平變化結(jié)果相一致。IL-22促進(jìn)SNP誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞Bcl-2、Bc