RNA干擾抑制COX-2合成以及對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的影響研究.pdf

1、立題依據(jù)：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA，簡(jiǎn)稱(chēng)類(lèi)風(fēng)關(guān))是常見(jiàn)的、慢性致殘性自身免疫性疾病之一。疾病的病因目前尚不清楚，可能的起始因子觸發(fā)了炎癥反應(yīng)，促使膜磷脂分解為花生四烯酸，在環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)等一系列酶的催化作用下，合成前炎癥介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)和細(xì)胞因子如白介素-1β(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interle

2、ukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumorousnecrosisfactor-α，TNF-α)等，后者通過(guò)多種途徑促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥持續(xù)進(jìn)展和關(guān)節(jié)的破壞。COX是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過(guò)程中的限速酶，有研究證實(shí)類(lèi)風(fēng)關(guān)患者滑膜組織COX-2表達(dá)顯著增加，它的活性高低直接關(guān)系到組織中前列腺素合成的量，在關(guān)節(jié)炎癥中最為重要的是PGE2。PGE2具有多種生物學(xué)功能，參與促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，增加了MMP(matrixmetalloprote

3、inase，基質(zhì)金屬蛋白酶)的合成和誘導(dǎo)軟骨的降解。COX-2和PGE2在促進(jìn)VEGF生成和關(guān)節(jié)滑膜新生血管形成中起著關(guān)鍵的作用。因此，本研究試圖尋找有效的小分子干擾RNA(siRNA，smallinterferingRNA)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAi，RNAinterfering)來(lái)特異性地抑制人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞COX-2(hCOX-2，humanCOX-2)基因的表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞水平探討hCOX-2基因的生物學(xué)功能，初步探討抑

4、制類(lèi)風(fēng)關(guān)炎癥進(jìn)展和關(guān)節(jié)破壞的新途徑。 主要研究目的：篩選和體外合成hCOX-2siRNA，并轉(zhuǎn)染入人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞，旨在篩選出并合成能夠特異性阻斷人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2生成的siRNA。次要研究目的進(jìn)一步分析特異性地阻斷人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2合成的siRNA對(duì)前炎癥介質(zhì)PGE2和致炎癥性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α合成的作用，了解其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelia

5、lgrowthfactor，VEGF)合成的影響；觀察hCOX-2siRNA對(duì)人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 研究方法：實(shí)驗(yàn)的滑膜組織取之于行滑膜切除術(shù)的類(lèi)風(fēng)關(guān)患者(符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的類(lèi)風(fēng)關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn))。通過(guò)分離、消化、培養(yǎng)和傳代滑膜成纖維細(xì)胞，液氮凍存。獲取人COX-2mRNA序列，設(shè)計(jì)和合成4條針對(duì)COX-2mRNAsiRNA(1＃-4＃siRNA)，1條隨機(jī)序列作為對(duì)照。分成A-H組，A組為未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照

6、；B-F組處理依次為隨機(jī)siRNA(NC)、1＃siRNA、2＃siRNA、3＃siRNA、4＃siRNA，G-H組為NS-398(COX-2選擇性抑制劑)濃度100μmol/L和濃度500μmol/L處理。另設(shè)立Hela細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。將復(fù)蘇后的人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞滴加于6孔板中，應(yīng)用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染，4小時(shí)后，各培養(yǎng)孔加入終濃度為200nmol/L的佛波酯(PMA)。分別在轉(zhuǎn)染36h和48h后收集滑膜細(xì)胞，提

7、取蛋白質(zhì)和總RNA，應(yīng)用半定量的RT-PCR檢測(cè)hCOX-2mRNA表達(dá)水平，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)hCOX-2蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)hCOX-2下游產(chǎn)物PGE2的水平。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。檢測(cè)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF水平。比較COX-2表達(dá)水平和細(xì)胞因子水平之間相關(guān)性。觀察各組成纖維細(xì)胞形態(tài)和通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞死亡數(shù)目。采用χ2檢驗(yàn)比較

8、未處理陰性對(duì)照組(CTL)與不同處理組之間以及不同處理組之間細(xì)胞死亡率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有無(wú)差別。 結(jié)果： (1)RT-PCR檢測(cè)各組人滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2mRNA水平：轉(zhuǎn)染48h后，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(CTL)、隨機(jī)序列對(duì)照組(NC)、陽(yáng)性對(duì)照Hela細(xì)胞組條帶相比，4＃siRNA有明顯的抑制效果。通過(guò)應(yīng)用GelWork軟件對(duì)各組凝膠密度掃描，在內(nèi)參照豐度基本相等的前提下，以CTL組為對(duì)照，NC、1＃siRNA、2＃RNA、

9、3＃RNA、4＃siRN、陽(yáng)性對(duì)照Hela細(xì)胞組與CTL組條帶密度比值分別為0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1。NC、1＃siRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃siRN、100μmol/LNS398、500μmol/LNS398各組與CTL組hCOX-2mRNA條帶密度比值分別為0.71、0.19、0.16、0.25、0.04、2.05和0.63，提示4＃siRNA干擾COX-2mRNA表達(dá)的效率明顯高于陰性對(duì)照組、

10、其他siRNA組，也優(yōu)于100μmol/LNS398和500μmol/LNS398。 (2)Western檢測(cè)各組人滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2蛋白表達(dá)的水平：轉(zhuǎn)染36h后，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(CTL)、隨機(jī)序列對(duì)照組(NC)、陽(yáng)性對(duì)照Hela細(xì)胞組相比，1＃siRNA、2＃siRNA、3＃siRNA組無(wú)明顯的抑制效果，4＃siRNA組抑制效果明顯。采用GelWork軟件對(duì)各組條帶行凝膠密度掃描，在內(nèi)參照ActinmRNA豐度基本相等

11、的前提下，NC、1＃siRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃siRN、Hela細(xì)胞組與CTL組hCOX-2蛋白密度比值分別為1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48，提示4＃siRNA干擾COX-2蛋白表達(dá)效率明顯優(yōu)于未處理組和其他siRNA組；轉(zhuǎn)染48h后，4＃siRNA組條帶明顯較其他組條帶色淡，NC、1＃siRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃siRN、Hela細(xì)胞組與CTL組hCOX-2蛋白條帶密度比值分別為1.05、

12、0.52、0.51、0.9、0.15，此結(jié)果與PCR一致。提示4＃siRNA能顯著抑制人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2蛋白表達(dá)。 (3)人滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平的測(cè)定：在轉(zhuǎn)染后24h、36h和48h，4＃siRNA組滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平均較其他各組為低，且在轉(zhuǎn)染后第24h至36h之間下降幅度最為明顯。4＃siRNA組在轉(zhuǎn)染24h、36h、48h后也較100μmol/LNS398組水平低，與500μ

13、mol/LNS398組水平相近。 (4)人滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF水平的測(cè)定：4＃siRNA組致炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和VEGF下降水平較CTL、隨機(jī)序列對(duì)照組、其他siRNA組為低；與100μmol/LNS398組比較，在24h、36h下降顯著，與500μmol/LNS398組趨勢(shì)相類(lèi)似和水平相接近，但在48h時(shí)略高于500μmol/LNS398組。 (5

14、)siRNA對(duì)人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞hCOX-2mRNA表達(dá)與培養(yǎng)上清液PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平相關(guān)性影響：在轉(zhuǎn)染24h時(shí)，TNF-α水平和hCOX-2表達(dá)無(wú)相關(guān)性外，不同siRNA處理組分別在24h、36h、48h時(shí)，隨著COX-2mRNA表達(dá)水平下降，滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2、IL-1β、TNF-α、VEGF水平也隨之明顯下降。提示siRNA不同處理組COX-2mRNA表達(dá)水平分別與PGE2、IL-1β

15、、TNF-α、VEGF水平呈平行關(guān)系。 (6)干擾COX-2表達(dá)后對(duì)人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響：不同siRNA處理組成纖維細(xì)胞死亡率在9﹪～11﹪，各組與CTL組相比死亡細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差別(P值均大于0.05)。4＃siRNA組與其他siRNA處理組在死亡細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差別(P值均大于0.05)。與500μmol/LNS398組比較，4＃siRNA組細(xì)胞死亡率與之相近(11﹪)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差別(P值均大

16、于0.05)。各組在外觀形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯差別，提示RNAi對(duì)人滑膜成纖維細(xì)胞毒性沒(méi)有明顯增加，4＃siRNA較其他siRNA有效地抑制hCOX-2表達(dá)的同時(shí)，其成纖維細(xì)胞死亡細(xì)胞數(shù)并未較其他組增加。 結(jié)論4＃siRNA(針對(duì)COX-2mRNA靶序列CGTTCGACTGAACTGTAGA)能有效地抑制人類(lèi)風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)和COX-2蛋白的合成，且同時(shí)抑制其合成PGE2和炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF