E2F2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：⑴探討E2F2在RASFs中發(fā)揮的生物學(xué)功能；⑵研究E2F2在RASFs中異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制；⑶探討E2F2調(diào)控RASFs活性的致病途徑。
　　方法：①取置換關(guān)節(jié)手術(shù)的RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織，體外進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲取RA滑膜成纖維細(xì)胞RASFs; RT-qPCR和Western Blot法分別檢測(cè)E2F2在RASFs和OASFs中的表達(dá)情況;設(shè)計(jì)并合成E2F2的small interfering RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染RA

2、SFs以沉默E2F2的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染negative siRNA(NC)為陰性對(duì)照組;檢測(cè)干擾效率并篩選出干擾效率最佳的siE2F2，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);MTS法檢測(cè)E2F2沉默后RASFs的增殖能力變化;細(xì)胞劃痕和Transwell法檢測(cè)E2F2沉默后RASFs的遷移能力變化;Transwell法檢測(cè)E2F2沉默后RASFs的侵襲能力變化。②選擇重組白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(tumornecro

3、sis factor-α，TNF-α)，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）三種促炎因子刺激RASFs，RT-qPCR和Western Blot法檢測(cè)E2F2的變化及其與濃度和時(shí)間的關(guān)系;PDTC、static、PD98059分別阻斷NF-κB、STAT3、ERK信號(hào)通路的同時(shí)，用IL-6、TNF-α、LPS刺激RASFs，RT-qPCR和Western Blot法分別檢測(cè)E2F2的表達(dá)變化;染色質(zhì)免疫共沉淀法(Ch

4、romatin Immunoprecipitation，ChIP)驗(yàn)證信號(hào)通路與E2F2啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。③IL-6、TNF-α、LPS分別刺激RASFs，提取分離核蛋白及漿蛋白，WesternBlot檢測(cè)E2F2在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)變化，探討促炎因子對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F2的核定位的影響;RT-qPCR及ELISA檢測(cè)E2F2沉默后在RASFs中相關(guān)基因的表達(dá);RT-qPCR檢測(cè)RA血漿中E2F2與促炎因子水平之間的關(guān)系;用ChIP驗(yàn)

5、證E2F2與促炎因子啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合;E2F2沉默后，促炎因子刺激RASFs，RT-qPCR法和Western Blot檢測(cè)與E2F2相關(guān)的促炎因子的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：⑴E2F2在RASFs的表達(dá)高于在OASFs中的表達(dá)(*p＜0.05)。E2F2沉默后，在mRNA以及蛋白質(zhì)水平顯著降低RASFs中E2F2的表達(dá)(*p＜0.05)，干擾效率為78％; E2F2沉默后，RASFs的增殖速率降低（*p＜0.05），遷移能力顯著降低（

6、*p＜0.05），同時(shí)其侵襲能力也顯著下降（**p＜0.01）。⑵IL-6、TNF-α、LPS分別刺激RASFs，E2F2在mRNA以及蛋白水平的表達(dá)均顯著增加，且對(duì)三種促炎因子均有時(shí)間和濃度依賴性（*p＜0.05，**p＜0.01）;ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059能夠顯著逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)E2F2的誘導(dǎo)(*p＜0.05，**p＜0.01)，而NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC能夠顯著逆轉(zhuǎn)IL-6和TNF-α對(duì)E2F2的誘導(dǎo)（*p＜0.05

7、，**p＜0.01）。以上結(jié)果說明，促炎因子刺激能夠誘導(dǎo)RASFs中E2F2的表達(dá)，其中LPS通過ERK信號(hào)通路、IL-6和TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)E2F2的表達(dá)。進(jìn)一步的ChIP結(jié)果顯示NF-κB能夠與E2F2的啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合，驗(yàn)證了以上結(jié)果。⑶TNF-α，IL-6，LPS均能夠促進(jìn)E2F2入核，其中IL-6作用最顯著。E2F2沉默后RASFs中一些與炎癥、侵襲密切相關(guān)的基因包括TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-

8、6、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase2，MMP2)、MMP9和MMP13的表達(dá)均降低(*p＜0.05，**p＜0.01)。ELISA結(jié)果證實(shí)炎癥因子TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6分泌顯著降低(*p＜0.05，**p＜0.01)。沉默E2F2可以逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)RASFs中IL-6的誘導(dǎo);ELISA結(jié)果顯示RA血漿中E2F2與TNF-

9、α(r2=0.6142，P=0.0005)、IL-6(r2=0.5940，P=0.0008)均呈較強(qiáng)的線性關(guān)系。此外，ChIP結(jié)果顯示E2F2能夠與IL-6的啟動(dòng)子區(qū)直接結(jié)合。
　　結(jié)論：E2F2在RA滑膜組織中高表達(dá)，并參與RA滑膜成纖維細(xì)胞的異常增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在炎癥條件下，炎性因子TNF-α、LPS、IL-6均可誘導(dǎo)RASFs中E2F2的表達(dá);我們還發(fā)現(xiàn)，在RASFs中存在NF-κB/E2F2/IL-6