扁蒴藤素抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種發(fā)病原因不明，以持續(xù)性滑膜炎和全身關(guān)節(jié)性軟骨及骨破壞為特點(diǎn)的慢性自身免疫疾病，RA以滑膜炎癥和滑膜組織增生為主要病理特征，可引起關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，是人類主要的致殘?jiān)蛑??；こ衫w維細(xì)胞(synovialfibroblasts，F(xiàn)LS)在RA病理過程中起到了關(guān)鍵作用。在臨床病理上RA-FLS具有類腫瘤樣異常增殖、抗凋亡和釋放高水平促炎性細(xì)

2、胞因子的特性。FLS參與了RA發(fā)病過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，在RA病情進(jìn)展中扮演著重要角色，RA-FLS通過分泌產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎性細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了RA滑膜組織增生;同時(shí)，RA-FLS分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等參與胞外基質(zhì)降解及骨關(guān)節(jié)破壞，促進(jìn)血管新生。越來(lái)越多的證據(jù)表明，通過抑制RA-FLS的增殖，能有效防止RA患者的關(guān)節(jié)損傷，最大限度的改善病情以提高患者生活質(zhì)量。因此，抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖可

3、能是治療RA的一種可行有效的臨床方案，具有廣闊的前景。
　　由熱殺死結(jié)核分枝桿菌(Heat-killed M.tuberculousis H37Ra，Mtb)誘導(dǎo)的佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠（Adjuvant Arthritis Rat，AA）臨床表現(xiàn)及病理學(xué)的改變與臨床RA患者相似，是一種復(fù)制方法簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)，成模率較高的理想RA動(dòng)物模型。AA大鼠滑膜成纖維細(xì)胞(AA-FLS)較RA患者滑膜成纖維細(xì)胞(RA-FLS)更容易獲取，若可以

4、將AA-FLS用作RA的體外研究，可在短期內(nèi)培養(yǎng)獲得大量細(xì)胞模型。因此，我們對(duì)AA-FLS的培養(yǎng)方法及細(xì)胞特性進(jìn)行研究，綜合評(píng)價(jià)該細(xì)胞模型與RA患者滑膜成纖維細(xì)胞的相似性，探討其作為體外研究RA發(fā)病機(jī)制及抗RA藥物篩選的細(xì)胞模型的可行性。
　　過山楓（Celastrus aculeatus Merr.）屬于衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬植物，是我國(guó)民間風(fēng)濕骨病的常用藥，主要功效為清熱解毒、活血止痛，祛風(fēng)利濕常用于治療類

5、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等癥。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，過山楓的乙醇提取物可以顯著抑制AA大鼠滑膜炎癥，同時(shí)對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及軟骨損傷具有保護(hù)作用。扁蒴藤素(Pristimerin，Pris)是過山楓有效部位提取物之一，一種天然的木栓烷型五環(huán)三萜類化合物，研究報(bào)道扁蒴藤素具有抗炎，抗腫瘤等活性，隨著對(duì)扁蒴藤素的研究發(fā)現(xiàn)，扁蒴藤素能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。本課題組研究證實(shí)，扁蒴藤素能夠抑制RA滑膜炎癥和滑膜血管新生，具有明顯的抗RA作用。<

6、br>　　在前期研究的基礎(chǔ)上，我們以在體動(dòng)物和細(xì)胞模型為觀察對(duì)象，研究了扁蒴藤素對(duì)AA大鼠模型和AA-FLS細(xì)胞模型的影響，探討扁蒴藤素對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的作用，闡明其可能的分子機(jī)制。
　　目的:
　　1 建立佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞(AA-FLS)的培養(yǎng)方法并分析其生物學(xué)特性。
　　2 考察扁蒴藤素抑制佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠（AA大鼠）滑膜組織增生和佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞(AA-FLS)增殖的

7、藥效學(xué)作用。
　　3 闡明扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1 AA-FLS原代培養(yǎng)及特征分析
　　膠原酶法分離獲取AA-FLS細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察各代細(xì)胞形態(tài)特征，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞。CCK-8法檢測(cè)AA-FLS與正常大鼠FLS的增殖活性差異。ELISA測(cè)定細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌水平。Hochest33258法考察細(xì)胞凋亡狀態(tài)，Western Bolt檢測(cè)AA-FL

8、S細(xì)胞線粒體凋亡通路重要調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax及Pro-Caspase-3和Cleave-Caspase-3的表達(dá)水平。
　　2 扁蒴藤素對(duì)AA大鼠滑膜增生和AA-FLS增殖的抑制作用
　　2.1 動(dòng)物水平
　　佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型制備:SD大鼠隨機(jī)分組后，除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠于根尾部經(jīng)皮下一次性注射Mtb誘導(dǎo)劑制備AA大鼠模型。觀察記錄大鼠的一般體征，測(cè)定大鼠足體積變化，考察扁蒴藤素對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)

9、腫脹的改善作用。
　　2.2 組織水平
　　大鼠膝關(guān)節(jié)制作病理切片，通過HE染色觀察扁蒴藤素對(duì)滑膜細(xì)胞數(shù)量和滑膜組織增生等病理改變的影響作用。
　　2.3 細(xì)胞水平
　　CCK-8法和臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度扁蒴藤素對(duì)AA-FLS增殖抑制的作用。
　　3 扁蒴藤素對(duì)AA-FLS增殖抑制的作用機(jī)制
　　3.1 扁蒴藤素對(duì)AA-FLS細(xì)胞周期的影響
　　用不同濃度的扁蒴藤素處理AA-FLS細(xì)胞后，

10、通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)AA-FLS細(xì)胞周期進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞周期分布比例的變化與差異，評(píng)價(jià)扁蒴藤素對(duì)AA-FLS細(xì)胞周期的作用影響。
　　3.2 扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS凋亡的作用
　　采用Hoechst33258染色的方法，對(duì)不同濃度扁蒴藤素干預(yù)后的AA-FLS進(jìn)行染色，觀察各組熒光染色結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，探討扁蒴藤素誘導(dǎo)AA-FLS凋亡的作用。
　　3.3 扁蒴藤素調(diào)控AA-FLS中線粒體凋亡通路蛋白水平的表達(dá)

11、r>　　通過Western Blot的方法，檢測(cè)不同濃度扁蒴藤素對(duì)AA-FLS中Bcl-2、Bax和Pro-Caspase-3、Cleave-Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1 AA-FLS的原代培養(yǎng)及生物學(xué)特性
　　1.1 AA-FLS的原代培養(yǎng)
　　原代培養(yǎng)所得的細(xì)胞經(jīng)傳代純化后形態(tài)規(guī)則，呈典型梭形形態(tài)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒顯示細(xì)胞vimentin表達(dá)呈陽(yáng)性，CD68表達(dá)為陰性，結(jié)果表明分

12、離所得為AA-FLS，原代培養(yǎng)成功。
　　1.2 AA-FLS的生物特性
　　(1) AA-FLS的增殖活性:細(xì)胞傳代培養(yǎng)第1～4d，AA-FLS和正常大鼠FLS均增殖緩慢;細(xì)胞傳代培養(yǎng)后第4d開始，AA-FLS增殖速度明顯高于正常大鼠FLS，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，AA-FLS細(xì)胞數(shù)量倍增所需的時(shí)間較正常大鼠FLS短，AA-FLS有較強(qiáng)的增殖活性。
　　(2) AA-FLS細(xì)胞的炎性因子表達(dá)水平:AA-F

13、LS與正常大鼠FLS相比，TNF-α和IL-1的表達(dá)水平升高(P＜0.01)。
　　(3) AA-FLS細(xì)胞凋亡率:AA-FLS細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)明顯抑制狀態(tài)，熒光顯微鏡下大多數(shù)細(xì)胞核呈彌散而微弱的藍(lán)色熒光，極少細(xì)胞核會(huì)出現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，此結(jié)果表明AA-FLS極少細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。AA-FLS細(xì)胞凋亡率低于正常大鼠FLS的細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)。
　　(4) AA-FLS中線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平:AA-FLS中抗凋亡蛋白

14、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量增高，差異有顯著性(P＜0.01);促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量有下調(diào)趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Pro-Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量有所增高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外本研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠FLS中并不表達(dá)Cleave-Caspase-3。
　　通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA-FLS具有增殖活躍、凋亡抑制和分泌高水平細(xì)胞因子的特性。
　　2 扁蒴藤素抑制AA大鼠滑膜炎癥和滑膜組織增生
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量

15、(0.40mg/kg)和高劑量（0.80 mg/kg）的扁蒴藤素均能使AA大鼠的足趾容積減小，明顯減輕AA大鼠的足腫脹程度而改善病情，扁蒴藤素濃度越高時(shí)改善病情效果越明顯。大鼠膝關(guān)節(jié)的病理切片HE染色結(jié)果分析表明，低劑量和高劑量組的扁蒴藤素均能阻斷AA大鼠滑膜組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減少滑膜組織增生。
　　3 扁蒴藤素抑制AA-FLS細(xì)胞增殖
　　扁蒴藤素能抑制AA-FLS的增殖，扁蒴藤素（0.75μM、1.5μM、3μM、5μ

16、M、10μM）作用后的AA-FLS，各組細(xì)胞活性顯著低于空白對(duì)照組;扁蒴藤素（0.75μM、1.5μM、3μM）干預(yù)后的AA-FLS細(xì)胞死亡率高于空白對(duì)照組細(xì)胞。扁蒴藤素能抑制AA-FLS增殖的作用具有劑量依賴性。
　　結(jié)論:
　　本項(xiàng)研究基于Mtb誘導(dǎo)的AA大鼠模型和AA-FLS細(xì)胞模型，通過研究扁蒴藤素對(duì)兩種模型的作用，評(píng)價(jià)扁蒴藤素的抗RA作用，闡明相關(guān)藥理作用機(jī)制，通過實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論:
　　1.建立了AA-FL

17、S細(xì)胞模型，并在細(xì)胞模型上觀察了細(xì)胞增殖和凋亡作用，細(xì)胞因子分泌水平等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該細(xì)胞模型與RA-FLS具有相似的特點(diǎn)，可以用于RA相關(guān)研究中。本實(shí)驗(yàn)中探討扁蒴藤素對(duì)RA-FLS的作用是基于AA-FLS細(xì)胞模型完成的。
　　2.扁蒴藤素顯著抑制AA-FLS增殖，減輕滑膜組織增生，從而達(dá)到抗RA的作用。
　　3.扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖的主要作用機(jī)制是誘導(dǎo)AA-FLS細(xì)胞周期的G0/G1期阻滯及誘導(dǎo)AA-FLS細(xì)胞凋亡