類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎為特點(diǎn)，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨甚至骨的破壞及關(guān)節(jié)功能的障礙，該病表現(xiàn)出進(jìn)展性及破壞性，極大影響患者的生活質(zhì)量。盡管RA的病因仍不清楚，近年來研究顯示活化的成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)，作為復(fù)雜細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一員，在RA的疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，從而引起了人們的重視。但鑒于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在中晚期病變的發(fā)病機(jī)制具有復(fù)雜性的特點(diǎn)，單一信號轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)通路的研究恐怕很難詳盡地闡述其發(fā)病機(jī)制，因此急需對RA 滑膜細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行深入探討。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種分析表達(dá)蛋白質(zhì)的主要技術(shù)，在過去的二十年里已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的發(fā)展領(lǐng)域。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的主要目的是在不同生理情況下，通過比較正常和疾病情況下的蛋白質(zhì)組學(xué)資料，來鑒定該疾病的生物標(biāo)志物，借此達(dá)到診斷或者治療的目的。不斷發(fā)展的高通量和基于敏感質(zhì)譜分析的技術(shù)為檢驗(yàn)各種生物樣本的生理學(xué)和病理生理學(xué)提供了新機(jī)會(huì)。

3、
　　 本課題的研究目的是用蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法比較RA 病人和正常人滑膜成纖維樣細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異來闡明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的發(fā)病機(jī)制。
　　 主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.采用shot-gun 法lable-free 方式進(jìn)行類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究：原代培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞，裂解后采用自動(dòng)化2D-Nano-LC-ESI-MS/MS分析肽段，每組重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，根據(jù)大于一個(gè) uniq

4、uepeptide和p>0.05,在RA 樣品中鑒定到1060種蛋白質(zhì)，在正常對照樣品中鑒定到1292種蛋白質(zhì)。
　　 2.差異蛋白質(zhì)篩選：利用兩樣本t 檢驗(yàn)和蛋白質(zhì)差異倍數(shù)方法篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。P<0.05,倍數(shù)>1.5的差異表達(dá)蛋白質(zhì)有100個(gè)。RA中上調(diào)的蛋白質(zhì)有46個(gè)，RA中下調(diào)的蛋白質(zhì)有54個(gè)。
　　 3.隨后進(jìn)行系統(tǒng)的差異蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析GO分析結(jié)果：對篩選到的差異蛋白進(jìn)行GO分析，GO 數(shù)據(jù)庫包含了

5、基因參與的生物過程，所處的細(xì)胞位置，發(fā)揮的分子功能三方面信息，結(jié)果提示在RA 滑膜成纖維細(xì)胞中血管生成相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，氧化還原相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。
　　 Pathway分析：對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG pathway分析，搜索KEGG 數(shù)據(jù)庫。共找到65個(gè)相關(guān)的pathway，其中ECM-受體相互作用、三羧酸循環(huán)、乙醛酸二羧酸代謝、心肌收縮、色氨酸代謝、氨基酰-tRNA 生物合成、膀胱癌、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、粘著斑、

6、煙酸及煙酰胺代謝、磷酸戊糖途徑、PPAR信號通路共14個(gè)pathway 明顯呈現(xiàn)蛋白質(zhì)富集（p<0.05）。
　　 基因網(wǎng)絡(luò)分析：同時(shí)整合3種不同的相互作用關(guān)系：1）KEGG 數(shù)據(jù)庫中基因之間的蛋白質(zhì)相互作用、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)修飾等關(guān)系；2）已有的高通量實(shí)驗(yàn)，如酵母雙雜交等證實(shí)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；3)已有文獻(xiàn)報(bào)道中提到的基因之間的相互作用，整合上述信息繪制基因網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中連接度高的基因，稱為Hub基因。Hub基因往往對網(wǎng)

7、絡(luò)的穩(wěn)定性起到重要作用，共找到與RA 關(guān)系最為密切的四個(gè)Hub基因，它們是CTGF、THBS1、FN1和SOD2。
　　 4.在RA和正常滑膜組織中進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的mRNA和蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證，結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致，即 THY-1、CTGF和THBS1表達(dá)上調(diào)，而SOD2表達(dá)下調(diào)。
　　 5.為了進(jìn)一步確認(rèn)血管形成相關(guān)因子THY-1, THBS1和CTGF的相互作用關(guān)系，我們進(jìn)行了CTGF和THY-1的RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)

8、果顯示在THY-1干擾下調(diào)之后，VEGF、 CTGF和THBS1的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)都下調(diào)了。同時(shí)在CTGF 干擾下調(diào)之后，VEGF的表達(dá)也下調(diào)了。然而，對照組的THBS1和THY-1的表達(dá)變化沒有顯著性差異。這些結(jié)果暗示在RA 疾病發(fā)展進(jìn)程中血管生成是一項(xiàng)重大事件，而THY-1是促進(jìn)血管生成的一個(gè)上游調(diào)控分子。THY-1可以調(diào)控THBS1和CTGF的表達(dá)，進(jìn)而影響VEGF的表達(dá)水平。
　　 6.個(gè)體驗(yàn)證RA 滑液和血清中

9、的四種Hub基因，發(fā)現(xiàn)CTGF、THBS1和FN1表達(dá)都有所上調(diào)，而SOD2 含量有所下調(diào)，有望成為新的臨床診斷指標(biāo)。
　　 綜上所述，在本次RA患者與正常人滑膜原代培養(yǎng)細(xì)胞的高通量比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，我們發(fā)現(xiàn)在RA患者中血管形成相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，而氧化還原相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)。這可能是血管翳形成的直接原因。血管形成的調(diào)節(jié)通路包括THY-1/THBS1/CTGF/ VEGF軸，該通路可能是促進(jìn)RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞中血管