TL1A活化滑膜成纖維細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜增生為特點(diǎn)，引起鄰近的軟骨組織和骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞的慢性炎癥浸潤的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。滑膜為軟骨供給營養(yǎng)，為關(guān)節(jié)提供潤滑液?；ひr里層由滑膜襯里層細(xì)胞構(gòu)成，滑膜襯里層細(xì)胞被稱為滑膜細(xì)胞，由巨噬細(xì)胞樣和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocytes，F(xiàn)LS)構(gòu)成。盡管T、B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞都參與了RA的發(fā)病機(jī)制，但滑膜成纖維細(xì)胞在該疾病中

2、發(fā)揮重要的作用?；ひr里中FLS分泌的多種細(xì)胞因子能夠加劇關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致軟骨組織受到侵蝕。既往研究表明，腫瘤壞死因子(TNF)與其相應(yīng)受體結(jié)合后能夠啟動RA中炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，在組織損傷和骨質(zhì)破壞中發(fā)揮了重要作用。腫瘤壞死因子樣配體1A(TL1A)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)，TL1A與RA的活動度密切相關(guān)。TNF-α和IL-β刺激RA患者FLS能夠產(chǎn)生TL1A，TL1A與其受體DR3結(jié)合后能夠誘導(dǎo)多種炎癥因子的生成和釋放

3、，從而放大炎癥效應(yīng)。目前，大部分關(guān)于TL1A在RA中的體外研究都是以T細(xì)胞為靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對TL1A刺激FLS后產(chǎn)生炎癥因子的檢測分析以及對TL1A作用于FLS的機(jī)制研究，進(jìn)一步探討RA中，TL1A在FLS中的作用，為TL1A在該疾病中的功能提供了一定的理論依據(jù)。
　　方法:(1)收集RA患者以及健康對照血清，通過ELISA方法檢測血清中TL1A的表達(dá);
　　(2)體外培養(yǎng)RA患者FLS，TL1A處理細(xì)胞后檢測細(xì)胞中相關(guān)炎

4、癥因子mRNA的水平，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的炎性因子濃度;
　　(3)TL1A刺激細(xì)胞前，用信號通路抑制劑處理細(xì)胞，通過對刺激后產(chǎn)生炎性因子表達(dá)水平的檢測，研究TL1A作用于FLS后所活化的信號通路;
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測FLS表面TL1A受體DR3，由于結(jié)果陰性，為證明TL1A如何作用于FLS，加入TNF受體拮抗劑處理細(xì)胞2小時，隨后以TL1A刺激，通過對刺激后所產(chǎn)生的炎性因子表達(dá)水平的檢測，研究TL1A與F

5、LS作用的機(jī)制;
　　(5)TL1A刺激FLS后棄去培養(yǎng)基洗凈殘留刺激劑，加入健康對照PBMC共培養(yǎng)3天，流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17的分群情況;
　　(6)蛋白芯片檢測3株經(jīng)TL1A處理48小時前后FLS培養(yǎng)基上清細(xì)胞因子水平，分析研究TL1A刺激FLS后所產(chǎn)生的細(xì)胞因子在RA中的用作。
　　結(jié)果:(1)ELISA檢測RA組與正常對照組血清中TL1A表達(dá)水平，RA組TL1A水平顯著高于正常對照組(P＜0.05)。
　

6、　(2)應(yīng)用RT-PCR和ELISA檢測TL1A刺激FLS不同時間點(diǎn)(0，6，24，48 h)FLS產(chǎn)生炎性因子的表達(dá)情況。TL1A刺激FLS6h后提取mRNA，RT-PCR結(jié)果顯示刺激后IL-6和PGE2表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，ELISA檢測IL-6表達(dá)水平結(jié)果顯示隨著刺激時間的延長，IL-6水平逐漸升高以48h最為顯著(P＜0.05)，PGE2的水平并未隨時間延長表現(xiàn)明顯趨勢，TL1A刺激組相較于未處理其水平都顯著升高(P

7、＜0.05)。
　　(3)在分別加入NF-κB、JNK抑制劑組中，TL1A刺激FLS產(chǎn)生IL-6水平相比未加入抑制劑直接刺激組顯著降低(P＜0.05)。TL1A刺激后FLS產(chǎn)生IL-6需通過NF-κB以及JNK的活化。
　　(4)FLS中未能檢測到DR3的表達(dá)。
　　(5)拮抗TNF受體1、2后加入TL1A刺激，結(jié)果顯示拮抗TNFR2后IL-6和PGE2水平顯著降低(P＜0.05)。TL1A能夠與FLS表面的TNFR2

8、結(jié)合發(fā)揮作用。
　　(6)PBMC與TL1A刺激后的FLS共培養(yǎng)，PBMC中Th17比例顯著上升(P＜0.05)。
　　(7)TL1A刺激FLS后培養(yǎng)基中大量趨化因子因子及生長因子水平升高。
　　結(jié)論:(1)TL1A促進(jìn)RAFLS產(chǎn)生IL-6通過NF-κB和JNK的激活。
　　(2)TL1A通過與TNFR2結(jié)合作用于FLS促進(jìn)IL-6的分泌。
　　(3)TL1A促進(jìn)RAFLS產(chǎn)生IL-6進(jìn)一步上調(diào)Th17。