HMGB1-LPS復(fù)合物促進滑膜成纖維細胞向類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)變.pdf

1、目的:通過研究系統(tǒng)闡述高遷移率族蛋白1(high mobility group box chromosomalprotein1，HMGB1)參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)疾病發(fā)生、發(fā)展和誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs）形成的分子機制，以及關(guān)鍵的信號通路。
　　 方法:為了進一步研究HMGB1-LPS

2、復(fù)合物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用及可能的信號通路，我們采取了體內(nèi)外實驗相印證的方法，探討HMGB1-LPS復(fù)合物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用，實驗分為兩個部分:
　　 第一部分:在本部分實驗中，我們?nèi)〗?jīng)關(guān)節(jié)置換手術(shù)骨關(guān)節(jié)炎病人滑膜組織分離出的滑膜成纖維細胞與HMGB-LPS復(fù)合物共培養(yǎng)5-8代，作為實驗組細胞(t-OASF);取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞作為陽性對照(RASF)，骨性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞作為陰性對照(OAS

3、F)。細胞均用含有1％FBS的DMEM培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)基換成含10％FBS的DMEM再培養(yǎng)24h;收集細胞，用PI染色后采用流式細胞儀分析3組細胞細胞周期的變化，探討HMGB-LPS復(fù)合物對細胞周期的影響，是否能促進細胞增殖。使用凋亡誘導(dǎo)劑處理細胞8小時后，收集細胞經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況、Western blotting檢測細胞中Bcl-2和Bax表達的變化，探討HMGB-LPS復(fù)合物作用于細胞后能否使細胞的凋亡受到抑制并減少

4、。為了檢測三組細胞在一定條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬的能力，使用10％FBS的DMEM將細胞在經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上生長24h后、將培養(yǎng)基換成PBS處理細胞4h，進行免疫熒光染色并用激光共聚焦觀察自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的產(chǎn)生情況;采用Western blotting檢測細胞中LC3Ⅱ的表達情況。為了觀察三組細胞HMGB-LPS復(fù)合物相關(guān)受體(TLR2、TLR4和RAGE)及與細胞粘附和遷移相關(guān)分子等的表達情況，采用流式細胞儀檢測粘附分子(ICA

5、M、VCAM)、趨化因子(CCL2、CXCL12)和相關(guān)受體的表達情況。為了明確3組細胞促炎因子和蝕骨的MMPs表達差異，采用ELISA和Real-time PCR法檢測細胞培養(yǎng)上清液和細胞中促炎細胞因子(TNF-a、 IL-1β和IL-6)和MMPs(MMP-3和MMP-13)蛋白水平及mRNA水平的表達情況。為了闡明HMGB1-LPS復(fù)合物刺激滑膜成纖維細胞向類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞轉(zhuǎn)變可能的下游信號通路，我們使用PathScan

6、多靶點蛋白檢測試劑盒篩選三組細胞激活的下游信號通路的差異。
　　 第二部分:體內(nèi)實驗根據(jù)文獻(Nat Med.2009;15:1414-1420.)進行。將經(jīng)HMGB1-LPS復(fù)合物誘導(dǎo)的OASFs(t-OASFs)包裹人的正常軟骨，將此軟骨植入SCID小鼠一側(cè)腹部皮下，兩個月后取出軟骨經(jīng)固定包埋后切片進行常規(guī)HE染色、阿利新藍和Masson特殊染色、免疫組化染色等分析和觀察，并根據(jù)染色結(jié)果進行病理評分;比較3組細胞對人軟骨造成

7、的損傷程度。
　　 結(jié)果:
　　 1、與OASF組細胞相比較， t-OASF組細胞進入S/G2期明顯增多，細胞增殖加快。
　　 三組細胞用1％FBS的DMEM培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基換成含10％FBS的DMEM再培養(yǎng)24h，細胞經(jīng)PI染色后流式細胞儀檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OASF組處于S期的細胞有16.83％，處于G2期的細胞僅有0.07％; t-OASF組處于S期的細胞為30.82％，G2期的細胞為26.96％; RAS

8、F組處于S期的細胞為9.17％，G2期細胞為22.28％。與OASF組比較，t-OASF組細胞的增殖明顯加快，有更多的細胞越過G1/G2checkpoint進入S/G2期，并與RASF組一致。
　　 2、經(jīng)凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后t-OASF組細胞凋亡明顯降低，促存活蛋白(Bcl-2)表達上調(diào)、促凋亡蛋白(Bax)表達降低。
　　 文獻報道RASFs對于外界刺激可通過降低凋亡的敏感性、從而提高存活率。為了評價t-OASFs對凋亡

9、的敏感性，我們使用TNF-α處理細胞8h后，收集細胞經(jīng)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)OASF組凋亡細胞占8.21％，壞死細胞占6.57％;t-OASF組的凋亡細胞占2.74％，壞死細胞占3.16％; RASF組凋亡細胞占1.08％，壞死細胞占2.14％。相比于OASF組，t-OASF組凋亡和壞死的細胞比例大大降低;用western blotting分別檢測Bcl-2和Bax，發(fā)現(xiàn)在三組細胞中OASF組細胞Bcl-2的表達明顯低于t-O

10、ASF組及RASF組，而Bax的表達則明顯高于t-OASF組及RASF組細胞。表明t-OASF組細胞與RASF組細胞相似，凋亡-存活平衡機制受損;在遭遇有害刺激時，t-OASF組細胞的存活比例增加。
　　 3、t-OASF組細胞自噬增多，逃避凋亡。
　　 研究證實RASFs在饑餓或雷帕霉素等處理時，可通過增加自噬來逃避細胞凋亡。為了評價t-OASFs產(chǎn)生自噬的能力，我們將細胞在經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上生長24h，達到6

11、0％的融合度后將培養(yǎng)基換成PBS處理細胞4h（饑餓），再將細胞做免疫熒光抗體染色、激光共聚焦顯微鏡觀察自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的產(chǎn)生情況，同時用Westernblotting檢測LC3Ⅱ的表達差異。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)t-OASF組細胞產(chǎn)生LC3Ⅱ的數(shù)量與RASFs相似，明顯多于OASF組;Western blotting檢測也證實t-OASF組和RASF組細胞LC3Ⅱ的表達明顯高于OASF組細胞。這些結(jié)果表明:t-OASF組細胞自噬

12、增多，導(dǎo)致細胞凋亡的減少。
　　 4、與OASF組細胞相比較，t-OASF組細胞HMGB1-LPS復(fù)合物相關(guān)受體表達上調(diào)。
　　 HMGB1生物學(xué)活性是通過與細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活一系列下游信號途徑來達到的，主要為TLR2、TLR4和RAGE。本課題組前期的研究已發(fā)現(xiàn):RASFs表面TLR2和TLR4的表達上調(diào)。為了分析t-OASF組細胞HMGB1-LPS復(fù)合物相關(guān)受體的表達變化，我們將培養(yǎng)的三組細胞采用流式細胞儀

13、檢測TLR2、TLR4和RAGE的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與OASF組細胞相比較（TLR2為6.7％、TLR4為18.4％和RAGE為2.6％），t-OASF組細胞表面TLR2、TLR4和RAGE表達明顯增加，分別為16.1％、26.1％和9.0％。目前已發(fā)現(xiàn)細胞表面的TLR4可在細胞受到某些細胞因子的刺激或長期培養(yǎng)后出現(xiàn)脫落或向胞內(nèi)翻轉(zhuǎn)，OASFs在體外培養(yǎng)培養(yǎng)5代后，細胞表面的TLR4可以出現(xiàn)向胞內(nèi)翻轉(zhuǎn)。因此，我們采用流式細胞儀胞內(nèi)染色分

14、析法觀察了RASF組細胞胞內(nèi)TLR4的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASFs胞內(nèi)TLR4的表達量為19.8％，表面TLR4的表達量為10.2％，證實體外長期培養(yǎng)后RASF上的TLR4會向胞內(nèi)翻轉(zhuǎn)。
　　 5、t-OASF組細胞與細胞遷移和趨化相關(guān)的表面分子表達上調(diào)
　　 RASFs表面趨化因子受體和粘附分子表達的上調(diào)，是導(dǎo)致炎癥局部淋巴細胞浸潤、免疫病理損傷的關(guān)鍵因素之一。為了明確t-OASF組細胞表面粘附分子和趨化因子受體表達與

15、其他兩組細胞的差別，我們采用流式細胞儀對三組細胞進行了檢測。結(jié)果顯示:t-OASF組細胞CCL2、CXCL12、ICAM和VCAM的表達分別為41.6％、42.1％、78.4％和2.8％，均明顯高于OASF組細胞（33.4％、21.4％、68.7％和2.0％），與RASF組細胞各分子的表達情況比較相同（55.7％、28.8％、77.2％和5.7％）。提示:HMGB1-LPS復(fù)合物可以上調(diào)t-OASF組細胞表面趨化因子受體和粘附分子的表達

16、，招募淋巴細胞、單核巨噬細胞等免疫活性細胞在關(guān)節(jié)局部的浸潤。
　　 6、t-OASF組細胞炎癥相關(guān)性信號通路分子NF-κB、SAPK/JNK和p38 MAPK明顯激活
　　 炎癥相關(guān)性信號通路分子，例如NF-κB、SAPK/JNK等在RASFs趨化因子受體表達上調(diào)、MMPs產(chǎn)生增加、凋亡和自噬的控制失調(diào)等病理性作用中均至關(guān)重要。我們使用商品化的PathScan試劑盒對三組細胞中炎癥相關(guān)的細胞內(nèi)關(guān)鍵信號蛋白的激活情況進行了

17、檢測，結(jié)果顯示:t-OASF組細胞NF-κB、SAPK/JNK和MAPK p38的激活水平明顯高于OASF組細胞。
　　 7、t-OASF組細胞促炎細胞因子（TNF-a、IL-1β和IL-6）及MMPs mRNA水平和蛋白水平表達上調(diào)
　　 RASFs表達高水平的促炎因子、趨化因子和MMPs，而促炎因子又可增強RASFs對骨質(zhì)的破壞。為了評價t-OASF組細胞的激活狀態(tài)，我們使用Real-Time PCR法檢測了三組細胞

18、TNF-a、IL-1β、IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA的表達水平;采用ELISA法檢測了三組細胞培養(yǎng)上清液中TNF-a、IL-1β、IL-6及MMP-3、MMP-13的蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)t-OASF組細胞TNF-a、IL-1β、 IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA的表達均明顯高于OASF組細胞(P＜0.05)。t-OASF組細胞培養(yǎng)上清液中TNF-a、IL-1β、IL-6及MMP-3、MMP-13的水平也顯著高于OA

19、SF組細胞(P＜0.05)。與RASF組細胞相比較，t-OASF組細胞TNF-a、IL-1β、 IL-6及MMP-3、MMP-13mRNA與蛋白水平的表達無明顯差異。
　　 8、t-OASF組細胞可以誘導(dǎo)SCID小鼠模型中植入的正常軟骨出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞
　　 由于RASFs可以產(chǎn)生大量的MMPs等基質(zhì)降解酶類，可以造成關(guān)節(jié)軟骨的降解和破壞。為了評價t-OASF組細胞對軟骨的致病性，我們將t-OASF組細胞、OASF組細

20、胞和RASF組細胞分別與正常人軟骨包埋入可吸收海綿內(nèi)，均植入SCID小鼠一側(cè)腹部皮下，2個月后取出軟骨進行常規(guī)病理檢查、特殊染色和免疫組化檢查。常規(guī)病理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)與植入OASF組細胞的軟骨相比，植入t-OASF組細胞的軟骨基質(zhì)遭到較嚴重的破壞，軟骨細胞退化和皺縮明顯。阿利新藍與Masson特殊染色結(jié)果顯示植入t-OASF組細胞的軟骨組織染色變淺，細胞退化明顯，表明該軟骨組織中膠原和酸性粘多糖成分明顯減少，骨質(zhì)呈嚴重破壞。免疫組化結(jié)果顯

21、示植入t-OASF組細胞的軟骨人類特異性pro-MMP13表達的陽性細胞顯著增多。根據(jù)植入軟骨的病理檢查和染色結(jié)果進行病理評分，OASF組平均得分為為1.5、t-OASF組為3.8、RASF組為5，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析OASF組與t-OASF組的差別存在統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:我們前期的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1-LPS復(fù)合物可以誘導(dǎo)DBA/1小鼠出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎癥病理改變，提示HMGB1-LPS復(fù)合物可以介導(dǎo)RASFs的形成

22、，導(dǎo)致RA的病理損傷。在本研究中，我們證實了HMGB1-LPS復(fù)合物較長期刺激OASFs，能夠促進OASFs轉(zhuǎn)化為RASFs樣細胞，具有與RASFs相似的生物學(xué)性狀，包括該細胞增殖明顯，處于S/G2期的細胞增多;并通過促進自噬的產(chǎn)生，減少細胞的凋亡;識別SFs上的TLRs和RAGE受體上調(diào)它們的表達，同時激活下游NF-κB、SAPK/JNK和p38 MAPK信號通路，導(dǎo)致促炎細胞因子（TNF-a、IL-1β和IL-6）、趨化因子受體(C

23、CL2、CXCL12)、粘附分子（ICAM、VCAM）的表達和分泌上調(diào)。在SCID小鼠模型證實經(jīng)HMGB1-LPS復(fù)合物誘導(dǎo)OASFs轉(zhuǎn)化的RASFs樣細胞具有明顯的致病性，可以破壞正常軟骨組織。上述結(jié)果提示:外源性PAMP(LPS)與內(nèi)源性DAMP(HMGB1)結(jié)合形成復(fù)合物，可以識別SFs上的TLRs/RAGE受體，引起下游信號通路的激活，造成促炎因子、趨化因子和骨質(zhì)破壞性酶類產(chǎn)生增加，致使正常SFs轉(zhuǎn)化為RASFs，最終導(dǎo)致RA的