穿心蓮內酯誘導人類風濕關節(jié)炎纖維細胞樣滑膜細胞凋亡和細胞周期停滯作用的研究.pdf

1、背景:
　　類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)是一種自身免疫性疾病,病理上以滑膜增生和軟骨降解為特征,滑膜的前端以血管翳進行性侵襲和破壞骨關節(jié),這種血管翳中主要由纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)組成,同時伴有大量的淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。在類風濕關節(jié)炎病人中,這種纖維細胞樣滑膜細胞的侵襲是破壞骨關節(jié)的主要因素。如果有辦法抑制纖維細胞樣滑膜細胞的生長,則可

2、以對類風濕關節(jié)炎病人的病情緩解起到一定的作用。
　　穿心蓮(Andrographis paniculata)是爵床科穿心蓮屬植物,穿心蓮內酯(Andrographolide)是中藥穿心蓮的主要活性成分,它是一種二萜類內酯類化合物,具有清熱解毒,涼血消腫的功效。基礎研究和臨床領域的多項研究證明,穿心蓮內酯有多種功效,如免疫調節(jié)、抗菌、抗炎、抗腫瘤、治療心腦血管疾病等。以往的研究中也有穿心蓮內酯誘導細胞凋亡和降低細胞活性的報道,大型臨

3、床試驗中也發(fā)現(xiàn)穿心蓮內酯對類風濕關節(jié)炎病人的癥狀緩解有一定的作用。但是,其具體的作用機制還不是十分清楚。因此,通過本實驗,探討穿心蓮內酯對風濕性關節(jié)炎骨關節(jié)滑膜細胞的作用及其機制,以期為臨床用藥提供參考。
　　目的:
　　培養(yǎng)纖維細胞樣滑膜細胞,研究穿心蓮內酯對纖維細胞樣滑膜細胞的作用,并對其作用機制進行研究。具體研究內容包括:
　　1.細胞培養(yǎng),培養(yǎng)纖維細胞樣滑膜細胞;
　　2.研究穿心蓮內酯對滑膜細胞的誘導凋

4、亡作用及其機制;
　　3.研究穿心蓮內酯對滑膜細胞的誘導細胞周期停滯作用及相關機制。
　　方法:
　　1.從15位接受關節(jié)置換術的類風濕關節(jié)炎病人中的關節(jié)滑膜中提取出纖維細胞樣滑膜細胞。15位病人隨即分為3個亞組,每一亞組中將提取出的滑膜組織混合在一起后再來提取細胞。首先將分離出的滑膜組織粉碎成直徑小于1mm的小顆粒,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,在37度用1mg/mL的膠原酶1進行溶解,震蕩2小時。反應后的細胞懸液

5、用孔徑70um的細胞過濾網(wǎng)過濾,然后用細胞培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng),培養(yǎng)基為達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM),培養(yǎng)基中有10％的胎牛血清和抗生素(100U/mL青霉素,100mg/mL鏈霉素),,條件設置為37攝氏度、二氧化碳濃度為5％。細胞培養(yǎng)基每3天更換一次,細胞鋪滿后按1:3的比例傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細胞與纖維細胞樣滑膜細胞形態(tài)一致,在顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的雙極形狀。在后續(xù)的實驗中每個實驗均做3次,每個亞組一次。
　　2.培養(yǎng)后的滑膜

6、細胞在無血清培養(yǎng)基中放置24小時后,用不同濃度的穿心蓮內酯進行干預,實驗分為四組:(1)空白對照組;(2)低濃度干預組,穿心蓮內酯用藥濃度為10mM/L;(3)中濃度干預組,穿心蓮內酯用藥濃度為20mM/L;(4)高濃度干預組,穿心蓮內酯用藥濃度為30mM/L。在藥物干預48小時后,進行各項實驗檢測。
　　3.檢測內容
　　(1)MTT法測定細胞生存率。將細胞種植于96孔板中,每個孔中的細胞數(shù)大約為10000個,24小時后用

7、上述四組藥物進行干預48小時,然后每孔中加入20μL的PBS溶液,其中MTT濃度為5 mg/mL,37攝氏度下培育4小時。用二甲基亞砜充分溶解還原物后用酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值,檢測波長540nm,參考波長690nm。
　　(2)流式細胞術檢測細胞周期。將細胞種植于六孔板中,每孔中的細胞數(shù)量為2×105,用上述四組藥物進行干預,48小時后,收集細胞,碘化丙啶染色,流式細胞儀檢測 DNA含量。
　　(3)凋亡檢測。參照

8、說明書,用膜連蛋白異氰酸熒光素試劑盒進行凋亡檢測。將細胞種植于6孔板中,每孔數(shù)量為2×105細胞,孵育24小時后,用上述四組不同濃度藥物干預48小時后,在暗房中用5μl膜連蛋白異氰酸熒光素和10μl碘化丙啶染色15分鐘,染色后馬上進行檢測。早期的凋亡細胞用膜連蛋白異氰酸熒光素染色為陽性,碘化丙啶染色為陰性。
　　(4)在提取細胞前,先用1％的十二烷硫酸鈉,0.1mM/L苯甲磺?；锖偷鞍酌敢种苿⒓毎芙?裂解物用離心機以13

9、000的轉速離心15分鐘,取上清以-80℃保存。提取細胞時先加入預冷的抽提試劑,抽提試劑中含有20mM/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸/氫氧化鉀(pH7.5),1.5mM/L氯化鎂,1mM/L EDTA,1mM/L二硫蘇糖醇,0.1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和蛋白酶抑制劑。然后,將裂解液以每分1000轉的轉速離心分離細胞核和未破損的細胞。上清液在4℃條件下以每分13000轉速離心15分鐘。剩余的上清液保存在-80℃以備后續(xù)檢測。用布拉德福德

10、蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。
　　(5)蛋白印跡分析。包括制膠、預電泳、加樣、電泳分離、轉膜、雜交、顯色和顯影定影等步驟。
　　(6)細胞凋亡蛋白酶3活性檢測。用凋亡蛋白酶3比色測定試劑盒,按照說明書進行檢測。將細胞種植于6孔板中,每孔數(shù)量為2×105細胞,孵育24小時后,用上述四組不同濃度藥物進行干預48小時,加入含有50mM HEPES、0.1％CHAPS、1mM DTT、0.1mM EDTA和0.1％Triton X-

11、100的溶解劑。細胞裂解液在4℃下以12000轉每分轉速離心10分鐘,將Caspase-3顯色底物Ac-DEVD-pNA加入離心后的上清液中,在37攝氏度條件下孵育1小時。陰性對照組未加入顯色底物。通過測量吸光度(405nm)來檢測凋亡蛋白酶3活性。
　　結果:
　　1.穿心蓮內酯可以抑制類風濕關節(jié)炎纖維細胞樣滑膜細胞的細胞增值并誘導細胞周期停滯。MTT結果說明穿心蓮內酯干預顯著抑制了滑膜細胞的增生;細胞周期檢測顯示S期和G

12、2/M期的細胞比例顯著下降,而G0/G1期的細胞比例上升。其中,在穿心蓮內酯高劑量干預組中,G0/G1期的細胞增多接近30％,S和G2/M期的細胞下降達到50％。在藥物干預組中還發(fā)現(xiàn),細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子p21和p27表達水平升高,細胞周期蛋白依賴激酶4水平下降。
　　2.穿心蓮內酯誘導類風濕關節(jié)炎纖維細胞樣滑膜細胞的細胞凋亡。V/PI染色顯示凋亡細胞的數(shù)量呈劑量依賴性增多。免疫印跡法顯示凋亡相關基因Bax表達水平升高,B

13、cl-2表達水平下降。同對照組相比,藥物干預組的Bcl-2/Bax的比率顯著下降。
　　3.穿心蓮內酯促進細胞色素C的釋放和細胞凋亡蛋白酶3的激活。免疫印跡結果顯示藥物干預組的剪切后細胞凋亡蛋白酶3表達水平升高,且這種表達水平的升高具有濃度依賴性。熒光底物標記的細胞凋亡蛋白酶3的水平也顯著升高。Western blot analysis顯示細胞色素c的表達水平也呈劑量依賴性的升高。
　　結論:
　　1.穿心蓮內酯抑制類