三水白虎湯抑制類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的作用靶點研究.pdf

1、研究背景:類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為中心病理的自身免疫病，其突出病理特點是滑膜增生并侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞畸形。RA滑膜成纖維細胞(FLS)大量增生并伴隨大量炎癥細胞浸潤和新生血管形成是滑膜增生的基礎(chǔ)，而RA-FLS增生的機制主要有二類，一是受多種致炎因子所驅(qū)動的炎癥性增生（被動性增生），這其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)起到主要作用;二是由于RA-FLS本身的細胞生物學(xué)特點發(fā)生改變，生長周期調(diào)控機制障礙

2、，出現(xiàn)類似腫瘤樣轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化細胞特征所致（主動性增生）。RA-FLS與正常人和其它關(guān)節(jié)炎滑膜細胞相比，其生物學(xué)特點產(chǎn)生了明顯的轉(zhuǎn)化細胞特征。RA的治療目標近年來已逐漸集中到真正阻斷滑膜增生和骨質(zhì)侵蝕方向，即所謂阻斷病情進展。近年來針對致炎因子所致的被動性增生治療靶點的生物制劑研究取得了較多成果，當前廣泛應(yīng)用的TNF-α拮抗劑能顯著控制RA的癥狀，并部分阻斷滑膜增生進程;IL-1拮抗劑已經(jīng)在臨床上用于RA的治療，還在臨床試驗階段的如IL-6

3、、IL-17拮抗劑也顯示出良好的治療效果。同時處于實驗階段的轉(zhuǎn)基因治療方法即是以抑制或阻止RA-FLS主動性增生為目標，也已顯示出良好的治療效果。如轉(zhuǎn)染fasl及fas相關(guān)性死亡決定蛋白(FADD)、NF-kb抑制蛋白（IkappaB）基因、陰性突變型原癌基因raf和myc等能誘發(fā)滑膜細胞大量凋亡，滑膜增生和軟骨侵蝕顯著受抑，甚至滑膜組織消失。
　　 類風濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹病”、“歷節(jié)”范疇?；顒悠谥嗅t(yī)病機主要是濕熱痹阻、痰凝

4、血瘀。根據(jù)上述病機以及我們多年的臨床經(jīng)驗，研制了三水白虎湯，由《千金》犀角散《廣濟》白虎方化裁而來，主要藥物有其藥物組成有:生地、水牛角、丹皮、寒水石、知母、青蒿泄熱透毒;虎杖、苡仁、白芥子、獨活、細辛除濕消腫;桑枝、雞血藤、蜈蚣、全蝎、地龍、南蛇藤、甘草通絡(luò)止痛。全方共奏清熱透毒、除濕消腫、通絡(luò)止痛之功效。該方目前在我科廣泛應(yīng)用于RA、OA、成人Still's病以及少年類風濕關(guān)節(jié)炎（包括系統(tǒng)型及少關(guān)節(jié)類型）活動期的治療，并取得了不錯的

5、臨床治療效果。一直以來，我們對該方進行了一系列的研究，從既往的藥理結(jié)果分析，該方的作用機制無疑是多途徑、多層次干預(yù)RA免疫炎癥的反應(yīng)的多個環(huán)節(jié)。既能抗炎鎮(zhèn)痛、又能抑制免疫，同時還有一個重要的作用是抑制滑膜成纖維細胞的增殖。三水白虎湯抑制RA-FLS增生的途徑可能既能抑制炎癥驅(qū)動的被動增生，又能抑制RASFs因轉(zhuǎn)化而出現(xiàn)的主動增生。根據(jù)我們前述的研究結(jié)果，三水白虎湯抑制被動增生的作用靶點可能主要是抑制了TNF-a的生成，并抑制了TNF-α

6、下游信號傳導(dǎo)分子NF-kβ和p38 MAPK信號通路。但復(fù)方中藥的藥理作用具有多靶點性，三水白虎湯抑制RA-FLS主動增生及被動性增生的其它靶點仍未明。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究試圖比較細胞在不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)表達的異同，對相關(guān)蛋白質(zhì)進行分類和

7、鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究而發(fā)展起來的研究蛋白質(zhì)生物化學(xué)性質(zhì)的一系列新興技術(shù)，通過在蛋白水平上對機體在生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達的不同以及對相關(guān)蛋白進行分類鑒定，進而從蛋白質(zhì)水平上闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的機制。通過將混合物中的蛋白質(zhì)分離出來，再對這些不同蛋白質(zhì)進行鑒定和比較，從而確定其濃度差異和（或）轉(zhuǎn)錄后修飾的差異。蛋白組學(xué)研究中的三大支

8、撐技術(shù)為雙向電泳、生物質(zhì)譜、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為RA的研究提供了一個新的手段。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)對RA患者血清、血漿、滑液、滑膜組織及滑膜細胞進行蛋白質(zhì)表達的種類和含量的研究，獲得RA患者與健康對照人群間差異表達的蛋白質(zhì)，并對某些蛋白進行了功能分析，從而推測RA早期診斷的可能生物標志。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)這一研究手段在國內(nèi)的復(fù)方中藥藥理研究中已有諸多報道

9、，利用該技術(shù)對中藥復(fù)方進行多靶點的高通量篩選，可以將中藥復(fù)方的多組分、多靶點、多途徑特點與蛋白質(zhì)表達相關(guān)聯(lián)。另一方面通過蛋白質(zhì)表達譜的差比性分析，還可以揭示中藥復(fù)方的作用靶點、作用環(huán)節(jié)和作用過程，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中的有效成分及各成分間的協(xié)同關(guān)系，進一步實現(xiàn)復(fù)方的優(yōu)化組合。一系列的研究成果對我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展對復(fù)方三水白虎湯治療RA的藥理研究具有重要借鑒意義。同時在試圖闡述中藥治療RA的改善病情作用機理的實驗研究中，既往有不少工作觀察了中

10、藥及復(fù)方對體外滑膜細胞培養(yǎng)、多種細胞因子以及信號傳導(dǎo)通路的影響，但這些作用更多只是結(jié)果，并不是真正的藥物作用靶點。本項目首次以篩選三水白虎湯作用于RA滑膜細胞的靶點蛋白為目標。同時鑒于復(fù)方中藥的藥理作用具有多靶點性，這也是復(fù)方中藥藥理研究的難點，為了縮小篩選范圍，本研究圍繞SSBH抑制RA-FLS增生這一重要藥理環(huán)節(jié)來尋找靶點，這樣既突出了SSBH的優(yōu)勢，又大大增加了技術(shù)上的可行性。
　　 本研究通過三水白虎湯含藥血清干預(yù)類風濕

11、關(guān)節(jié)炎(RA)、骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者的關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞，觀察該方對細胞增殖抑制情況，同時通過檢測培養(yǎng)細胞上清中IL-6、IL-17水平及雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析含藥血清干預(yù)后FLS蛋白表達圖譜，并篩選出與正常對照的差異表達蛋白質(zhì)點，尋求該方抑制類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的作用靶點，進一步探討該方治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制。
　　 第一章三水白虎湯對關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的影響
　　 研究目的:觀察三水白虎湯(

12、SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的滑膜成纖維細胞(FLS)增殖的影響，探討SSBH治療RA的作用機制。
　　 材料和方法:滑膜組織來自南方醫(yī)院脊柱骨科收治行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)確診的RA、OA患者共6例（每組3例）。組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，并通過倒置顯微鏡、流式細胞術(shù)、免疫細胞化學(xué)染色等方法進行鑒定。取3～6代細胞，MTT法連續(xù)檢測不同濃度(10％～30％)的含藥血清干預(yù)不同時間(24、48、72h)后對F

13、LS增殖的影響，并繪制細胞生長曲線。以來氟米特和生理鹽水含藥血清作對照。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進行分析，用均數(shù)加減標準差（(x)±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用One Way ANOVA單因素方差分析，多組間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni法。α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.FLS的原代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法2～3d后見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，一周后

14、細胞生長迅速，約2-3W長滿培養(yǎng)瓶底的70％-80％。
　　 2.FLS的鑒定在倒置顯微鏡下，所培養(yǎng)(RA、OA)細胞形態(tài)符合成纖維細胞的形態(tài)特征，呈紡錘狀、星形或梭形，部分可呈大多角形。細胞核邊界清楚，呈卵圓形，位于細胞的中間，核仁清晰。Vimentin、CD68免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示Vimentin染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性。流式細胞術(shù)檢測FLS CD55+細胞百分率為（98.4±2.29）％。

15、r>　　 3.MTT法檢測FLS的增殖率MTT結(jié)果顯示SSBH含藥血清可呈劑量和時間依賴性抑制RA、OA FLS的增殖。不同濃度(10％～30％)的SSBH干預(yù)FLS72h后，RA-FLS細胞增殖抑制率分別為11.7％、42.9％、42.7％(p＜0.001);OA-FLS細胞增殖抑制率分別為24.9％、47％、48％(p＜0.001);20％的含藥血清干預(yù)FLS不同時間(24、48、72h)后，RA-FLS細胞增殖抑制率分別為11.

16、3％、28.4％、42.9％(p＜0.001); OA-FLS細胞增殖抑制率分別為11.7％、33.9％、47％(p＜0.001)。不同濃度(10％～30％)的來氟米特(LEF)干預(yù)FLS72h后，RA-FLS細胞增殖抑制率分別為9.9％、39％、38％(p＜0.001); OA-FLS細胞增殖抑制率分別為26.8％、40％、40.8％(p＜0.001);20％的來氟米特(LEF)干預(yù)FLS不同時間(24、48、72h)后，RA-FLS

17、細胞增殖抑制率分別為15.5％、22.3％、39％(p＜0.001); OA-FLS細胞增殖抑制率分別為11.2％、26.1％、40％(p＜0.001)。無論是來源于RA還是OA，SSBH和LEF含藥血清作用于滑膜成纖維細胞48h后即表現(xiàn)出對細胞增殖的顯著抑制作用，72h達到高峰。對兩種來源的FLS，LEF與SSBH含藥血清的抑制效率大致相當。
　　 結(jié)論:中藥復(fù)方三水白虎湯能有效抑制關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞的增殖，這可能是該方治療

18、類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制之一。
　　 第二章三水白虎湯對關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維分泌IL-6、IL-17的影響
　　 研究目的:觀察三水白虎湯(SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)炎(RA、OA)患者滑膜成纖維細胞(FLS)分泌IL-6、IL-17的影響，探討該方治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制。
　　 材料和方法:組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，取3～6代細胞，加入20％含藥血清培養(yǎng)72h后收集各培養(yǎng)細

19、胞上清液，以來氟米特和生理鹽水含藥血清作對照。ELISA法檢測上清液中IL-6、IL-17的水平。操作嚴格按照試劑盒操作說明進行。最后于全自動酶標儀讀取A450值，根據(jù)標準反應(yīng)曲線求得樣品IL-6、IL-17的水平。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進行分析，用均數(shù)加減標準差（(x)±s）表示，α=0.05。
　　 結(jié)果:SSBH和來氟米特(LEF)均可顯著抑制RA-FLS上清液中IL-17的含量，與生理鹽水(

20、NS)對照組比較有顯著性差異;但SSBH與LEF兩組比較沒有顯著差異。SSBH與LEF對RA-FLS上清液中的IL-6含量卻無顯著影響。SSBH含藥血清對OA-FLS的IL-6和IL-17分泌量均未見明顯影響。
　　 結(jié)論:中藥復(fù)方三水白虎湯能顯著抑制類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞分泌IL-17，這可能是該方治療類風濕關(guān)節(jié)炎的藥理機制之一。
　　 第三章三水白虎湯抑制關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 研

21、究目的:應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析三水白虎湯(SSBH)含藥血清對體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)炎(RA、OA)滑膜成纖維細胞(FLS)蛋白表達差異并對差異蛋白加以鑒定，以期探尋SSBH抑制FLS增殖所表現(xiàn)出功能特性的分子基礎(chǔ)，進一步探討該方治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制。
　　 材料和方法:組織塊培養(yǎng)法收集RA、OA患者的關(guān)節(jié)FLS，體外培養(yǎng)傳代，取3～6代細胞，加入20％SSBH含藥血清培養(yǎng)，以加入生理鹽水制備的血清作對照，培養(yǎng)72h后，提取細胞總

22、蛋白，用雙向凝膠電泳(2-DE)分離細胞總蛋白，凝膠經(jīng)銀染顯色和圖像數(shù)據(jù)分析識別差異蛋白位點;將這些差異點進行膠內(nèi)原位酶解及利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行鑒定。
　　 結(jié)果:RA患者和對照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出833、859個蛋白質(zhì)點。OA患者和對照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出936、968個蛋白質(zhì)點。對二者相互匹配的蛋白質(zhì)點進行差異分析，以差異量大于3倍的表達量為準，在RA-

23、FLS中初步篩選出16個差異表達的蛋白質(zhì)斑點，其中表達上調(diào)和高豐度表達的蛋白有7個，下調(diào)表達的9個。在OA-FLS中初步篩選出24個差異表達的蛋白質(zhì)斑點，其中表達上調(diào)和高豐度表達的蛋白有11個，下調(diào)表達的13個。將這些差異點進行MALDI-TOF-MS分析，成功鑒定出26個點，其中在RA-FLS中，SSBH下調(diào)Centrosomal（中心體蛋白）;GSS（谷胱甘肽合成酶蛋白）;Microtubule-associated serine/

24、threonine-protein（微管相關(guān)性絲氨酸/蘇氨酸蛋白）;Desmoplakin（橋粒斑蛋白）;Interleukin-3 receptor(IL-3受體蛋白);DST（肌動蛋白結(jié)合蛋白）;Exocyst（泡外蛋白）;Centrosome-associated(中心體關(guān)聯(lián)蛋白);上調(diào)Protein OS-9; Sorcin(抗藥蛋白);Interleukin-1 receptor antagonist(IL-1受體拮抗蛋白)等

25、蛋白的表達。在OA-FLS中，SSBH下調(diào)Sulfatase-modifying factor2（硫酸酯酶修飾因子2）;Coiled-coil domain-containing protein（卷曲螺旋包含域蛋白）;Desmoplakin（橋粒斑蛋白）;Centromere-associated(著絲粒相關(guān)蛋白);Sickle tail protein homolog(鐮刀尾蛋白同系物);acidic ribosomal（酸性核糖體蛋

26、白）;上調(diào)Myosin-Ⅰc（肌球蛋白-Ⅰc）;RABGAP1L(Rab蛋白GTP酶激活蛋白1);Centrosomal（中心體蛋白）;Rootletin（小根蛋白）;inosine triphosphatepyrophosphatase(肌苷焦磷酸酶); Myosin-Ⅲa(肌球蛋白Ⅲa);Translocon-associated protein subunit delta（易位子相關(guān)蛋白亞基）;dioxygenase（雙加氧酶）;