Furin和PCSK6對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、論文分為四個(gè)部分:第一部分為綜述:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞;第二部分為綜述:弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生;第三部分:抑制furin表達(dá)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響;第四部分:抑制PCSK6對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響。
　　第一部分 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞
　　RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨的破壞為特征的系統(tǒng)性自身

2、免疫性疾病，目前在臨床上雖然治療手段很多，但仍沒(méi)有特異性的治愈方法。RA的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，包含許多類型細(xì)胞的參與:T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和FLS。分布于滑膜襯里層的FLS通過(guò)分泌多種介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、化學(xué)因子、生長(zhǎng)因子和其他的一些促炎性分子如前列腺素和白介素等，在炎癥的發(fā)生、維持、關(guān)節(jié)軟骨破壞過(guò)程中到起關(guān)鍵作用。RA的FLS可以表現(xiàn)出一些腫瘤細(xì)胞的特性，可能與P53基因功能的失活有關(guān)，產(chǎn)生獨(dú)特的侵襲性表型，使其能夠侵襲細(xì)胞外基質(zhì)，

3、進(jìn)一步加劇關(guān)節(jié)損傷。FLS是RA發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵因子之一。最近針對(duì)FLS的生物學(xué)研究進(jìn)展包括它對(duì)固有免疫的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)等。對(duì)FLS的深入研究可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LS可以作為RA患者的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，從而完善目前RA的治療。
　　第二部分 弗林蛋白酶furin——胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生
　　弗林蛋白酶furin在體內(nèi)介導(dǎo)了一個(gè)簡(jiǎn)單的生化反應(yīng)，催化前體蛋白水解為成熟蛋白。雖然這個(gè)反應(yīng)看似簡(jiǎn)單，furin生理作用卻極其重要。它

4、參與了人體內(nèi)的多種生理過(guò)程，是維持人體穩(wěn)態(tài)平衡的重要分子。與furin相關(guān)的疾病相當(dāng)廣泛，包括:阿爾茨海默病、腫瘤、炭疽和埃博拉出血熱等等。本篇綜述主要概括了furin的結(jié)構(gòu)、活性、細(xì)胞內(nèi)定位、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、作用底物、生物學(xué)特性以及與胚胎發(fā)生和多種疾病的關(guān)系。
　　第三部分 抑制furin表達(dá)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響
　　背景：
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎R(shí)A是以滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和

5、骨的破壞為特點(diǎn)的一種系統(tǒng)性疾病。在RA中，正常滑膜從相對(duì)的靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承院颓忠u性的滑膜翳組織。RA的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，多種細(xì)胞類型參與其中，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。其中，滑膜襯里層的FLS在RA的發(fā)病中起到了關(guān)鍵作用。FLS分泌一系列細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)以及多種蛋白水解酶，介導(dǎo)局部的炎癥反應(yīng)，以及參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨蛋白。RA患者來(lái)源的FLS的生物學(xué)特性不同于健康個(gè)體或骨性關(guān)節(jié)炎患者。這些炎性滑膜來(lái)源的滑膜細(xì)胞表現(xiàn)出

6、一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型特征，如細(xì)胞的錨定不依賴性生長(zhǎng)、過(guò)度增殖、細(xì)胞侵襲、以及對(duì)凋亡誘導(dǎo)的耐受等。在體外培養(yǎng)此類細(xì)胞時(shí)，這些滑膜細(xì)胞在沒(méi)有T細(xì)胞存在的情況下仍然可以長(zhǎng)時(shí)間保持其侵襲力和破壞力。說(shuō)明RA的關(guān)節(jié)破壞除了T細(xì)胞參與的自身免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制，也有不依賴T細(xì)胞的以FLS為中心的機(jī)制。這類滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)自分泌/旁分泌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，加重關(guān)節(jié)滑膜慢性炎性狀態(tài)和關(guān)節(jié)破壞。
　　RA的最近的一些治療進(jìn)展主要集中于針對(duì)炎性細(xì)胞因子和淋巴

7、細(xì)胞免疫的生物治療，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑，T細(xì)胞共刺激信號(hào)抑制劑，和B細(xì)胞清除劑等。在部分患者中這些生物治療是有效的。但仍有很大一部分患者對(duì)以上這些生物制劑沒(méi)有應(yīng)答。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)，尤其是針對(duì)RA的FLS的治療可能會(huì)完善現(xiàn)有治療方案。
　　Furin是PCs家族的重要成員之一，廣泛分布于機(jī)體各種細(xì)胞中。Furin主要位于細(xì)胞內(nèi)高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi n

8、etwork， TGN)，并在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞膜之間循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)。Furin能夠通過(guò)識(shí)別、剪切特定序列Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg，水解多種前體蛋白，這一剪切過(guò)程是多種蛋白成熟活化的關(guān)鍵步驟，對(duì)蛋白質(zhì)的功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究表明，furin參與了胚胎發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)和多種疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程。然而在生殖細(xì)胞中敲除furin會(huì)使胚胎死亡，因此furin在各種細(xì)胞中的作用缺乏基因敲除動(dòng)物這種有利的研究手段。既往有實(shí)驗(yàn)

9、發(fā)現(xiàn)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜翳中furin的表達(dá)明顯增加，但機(jī)制和作用尚不明了。Furin表達(dá)的上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜炎癥，也可能是滑膜對(duì)炎癥反應(yīng)或自身免疫時(shí)的一種代償。因此，研究滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的furin的作用是一個(gè)亟需解決的課題。
　　為了研究這個(gè)課題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)。將RA患者來(lái)源的FLS進(jìn)行體外培養(yǎng)，將其高表達(dá)的furin使用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因抑制，研究抑制furin對(duì)滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、分

10、泌炎癥因子的影響。從而證明furin在滑膜細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用。
　　目的：
　　探索RA患者FLS細(xì)胞上高表達(dá)的furin對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。
　　方法：
　　從RA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的滑膜組織中消化分離FLS進(jìn)行體外培養(yǎng)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小干擾RNA抑制細(xì)胞內(nèi)furin表達(dá)，并設(shè)置對(duì)照組小干擾RNA，驗(yàn)證siRNA-furin的干擾效率。進(jìn)一步的研究使用兩組furin差異表達(dá)的FLS進(jìn)行以下功能學(xué)實(shí)驗(yàn):(1

11、)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn);(2) Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn);(3)單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);(4)細(xì)胞周期分析;(5)細(xì)胞凋亡分析;(6)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)檢測(cè)FLS分泌白細(xì)胞介素(interleukin， IL) IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-17和TNF-α水平。研究?jī)山M細(xì)胞在增殖、侵襲、遷移、凋亡、分泌等生物學(xué)功能中的差異。
　　結(jié)果：

12、r>　　利用siRNA-furin或siRNA-control干擾RA患者的FLS上furin的表達(dá)，研究其功能差別。得到以下結(jié)果:
　　(1)siRNA-furin在mRNA水平和蛋白水平均有效抑制FLS的furin表達(dá)。
　　(2)RA滑膜來(lái)源的FLS上furin表達(dá)的下調(diào)增強(qiáng)FLS細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力;
　　(3)抑制furin表達(dá)加速FLS的細(xì)胞周期;
　　(4)抑制furin表達(dá)影響FLS的凋亡，

13、晚期凋亡和壞死細(xì)胞減少;
　　(5)抑制furin的表達(dá)使FLS分泌TNF-α和IL-1β增加;
　　結(jié)論：
　　(1)抑制RA滑膜FLS細(xì)胞上furin的表達(dá)增強(qiáng)了FLS細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等功能;
　　(2)RA滑膜細(xì)胞上furin的高表達(dá)可能是一種代償性反應(yīng)，抑制滑膜細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等表型;
　　(3) Furin在循環(huán)和局部的作用不盡相同，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　意

14、義：
　　RA是一種高度異質(zhì)性疾病，炎癥、免疫、代謝等多個(gè)方面參與其發(fā)病機(jī)制。毫無(wú)疑問(wèn)，關(guān)節(jié)滑膜襯里層的FLS是疾病的關(guān)鍵因子之一。我們發(fā)現(xiàn)，抑制RA滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的furin基因會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子的能力。因此furin可能會(huì)作為RA的治療靶點(diǎn)之一從而完善現(xiàn)有治療。
　　第四部分 抑制PCSK6對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和分泌功能的影響
　　類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎R(shí)A是以滑膜慢

15、性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞為特點(diǎn)的一種系統(tǒng)性疾病。RA來(lái)源的FLS表現(xiàn)出類似轉(zhuǎn)化細(xì)胞的侵襲特性，通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)以及多種蛋白水解酶，介導(dǎo)局部的炎癥反應(yīng)，參與降解細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨蛋白，加重RA的關(guān)節(jié)損害。PCSK6是一種Ca2+依賴的絲氨酸蛋白水解酶，參與多種肽的活化過(guò)程。既往研究顯示PCSK6具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性和增值能力的作用。而且與骨性關(guān)節(jié)炎相比，PCSK6在RA滑膜上表達(dá)增高。因此我們?cè)O(shè)計(jì)一系列實(shí)驗(yàn)研究PCSK6

16、對(duì)RA來(lái)源的FLS生物學(xué)功能的影響。
　　目的：
　　探索RA患者FLS細(xì)胞上PCSK6的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。
　　方法和結(jié)果：
　　從RA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的滑膜組織中消化分離FLS進(jìn)行體外培養(yǎng)，應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染FLS細(xì)胞抑制PCSK6表達(dá)，并行qRT-PCR和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證PCSK6在mRNA和蛋白水平表達(dá)的降低。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)包括:(1)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，證明抑

17、制RAFLS細(xì)胞PCSK6表達(dá)降低細(xì)胞的增殖能力;(2)Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，證明降低RA FLS細(xì)胞PCSK6表達(dá)抑制FLS細(xì)胞的侵襲能力;(3)單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，證明抑制PCSK6表達(dá)后RAFLS細(xì)胞遷移能力降低;(4) ELISA檢測(cè)FLS分泌功能，證明抑制PCSK6的表達(dá)使RAFLS分泌TNF-α水平降低。
　　結(jié)論：
　　(1)抑制PCSK6的表達(dá)降低了RA滑膜FLS細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和分泌炎癥因子等

18、功能;
　　(2)RA滑膜細(xì)胞上高表達(dá)的PCSK6可能通過(guò)促進(jìn)FLS的增殖、侵襲、遷移等加速RA的關(guān)節(jié)損害;
　　(3)PCSK6和furin雖然同屬PCs家族，但對(duì)RA FLS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響不同，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　意義：
　　PCSK6和furin雖然同屬PCs家族，但在RA的關(guān)鍵致病因子之一FLS細(xì)胞的生物學(xué)功能中的影響卻不同。其中涉及的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。需要我們的進(jìn)一步研究。因此PCs家族