家雞囊胚細胞嵌合體技術研究及應用.pdf

1、據常規(guī)嵌合體模型原理,利用具有"十全"特征的地方黑絲毛烏雞,提出多表現型遺傳標記嵌合體模型的概念,并應用于嵌合體檢測;通過對囊胚的分離與消化、赤道面開窗、不換殼培養(yǎng)以及供體BCs的轉移等一系列嵌合體制作技術的研究,建立家雞BCs嵌合體批量制作技術;結合新型GFP報告基因,研究以BCs嵌合體為手段的家雞外源基因導入途徑.此外,基于BCs嵌合體種系檢測的困境和同型嵌合體與種系嵌合率的關系,探索家雞w染色體PCR性別鑒定技術在此領域的應用.結

2、果顯示:①絲毛可作為家雞家雞嵌合體除黑羽以外的又一個表現型遺傳標記,但絲羽發(fā)生嵌合的難度更高.②利用受體種蛋赤道面開窗、蛋殼切塊復原、不換殼培養(yǎng)等改進的囊胚細胞嵌合體制作技術,實驗組最高出殼率為40％(29/73),據表現型判斷,出殼的嵌合體率18％(13/73),嵌合體胚26％(19/73).其中黑膚、毛腳、五趾、黑喙等供體特征也不同程度地出現在嵌合體雛雞中.③經嵌合體種系傳遞檢測,嵌合體♂×烏骨雞♀的測交組合,7只嵌合體公雞中有6號

3、、8號、11號、12號能分別產生比率為2.5％(3/118)、31.6％(6/19)、71.4％(15/21)、33.3％(18/54)的黑羽特征(羽色嵌合體模型意義上的種系嵌合體)后代.而且6號、8號、12號還得到了1.7％(2/118)、10.5％(2/19)、1.8％(1/54)的有"十全"特征(羽色和羽形嵌合體模型意義上的種系嵌合體)后代.嵌合體♀×烏骨雞♂的測交組合中,獲得黑羽、純?yōu)豕请u特征率分別為29.4％(35/119)、

4、1.7％(2/119).飼養(yǎng)至720d,有2只嵌合體公雞和所有3只嵌合體母雞仍保持了最初的各種嵌合體特征.④BCs在體外培養(yǎng)4h后,用pEGFP-C1質粒與脂質體(1mg/mL)進行轉染,參數為:脂質體5μL,質粒DNA 1.5μg,細胞密度為4個胚,脂質體與DNA形成復合物時間為30min,BCs與脂質體-DNA復合物共培養(yǎng)6h,加入血清后繼續(xù)培養(yǎng)12h.熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光的BCs并計數,轉染效率達30％.但隨后利用轉染BCs