牙髓干細胞形成牙體組織能力及其制備嵌合體牙齒的實驗研究.pdf

1、牙齒組織工程中局部誘導微環(huán)境的建立主要是通過支架材料或單因子誘導的方式，來促進牙髓干細胞的分化。由于牙齒發(fā)育的微環(huán)境異常復雜，涉及到上皮-間充質(zhì)相互作用以及多種基質(zhì)成分、礦物離子、生長因子的參與，單純依靠支架材料或某幾種生長因子等非生理誘導方式局限性較明顯，不能滿足組織工程化牙齒的形態(tài)發(fā)生要求。本研究擬通過模擬牙髓干細胞的體內(nèi)生長發(fā)育環(huán)境，以重組微環(huán)境的方式來調(diào)控牙髓干細胞的分化和形態(tài)發(fā)生，并在此基礎上，嘗試利用牙髓干細胞研制同種異體“

2、嵌合體牙齒”，以期為組織工程化牙齒最終的臨床應用探尋一條新的研究途徑。 所取得的主要研究結(jié)果如下： 1、組織工程化牙齒異位再生環(huán)境的篩選和驗證比較了出生后4 d 的封閉群SD 仔鼠磨牙牙胚器官，在同種異體宿主體內(nèi)不同部位的生長發(fā)育情況，結(jié)果表明腎被膜下的牙胚發(fā)育狀況接近正常；進一步將相關的牙齒組織塊移植至腎被膜下，同樣生長發(fā)育良好；單獨將牙乳頭細胞團進行腎被膜下移植，可以形成牙尖樣的牙本質(zhì)牙髓復合體。另外，我們還比較了傳

3、代前、后的牙胚細胞團在腎被膜下構(gòu)建組織工程化牙齒的可行性，結(jié)果表明：原代牙胚細胞團體內(nèi)可發(fā)育成典型的牙胚樣結(jié)構(gòu)，而第二代牙胚細胞團僅形成極少量的釉質(zhì)，覆蓋在牙本質(zhì)牙髓復合體表面。上述結(jié)果證實腎被膜下環(huán)境有利于牙胚及其相關組織、細胞的繼續(xù)生長發(fā)育。在腎被膜下的生長環(huán)境中，出生后的牙乳頭細胞、牙胚細胞可分別再現(xiàn)牙齒間充質(zhì)、牙胚早期的發(fā)育模式，說明牙齒形態(tài)發(fā)生所需的遺傳信息是儲存在離散后的單個牙源性細胞中的。 2、牙胚細胞誘導牙髓干

4、細胞分化的實驗為了驗證牙胚細胞所提供的發(fā)育微環(huán)境是否適合成體牙髓干細胞的增殖、分化，本實驗通過三種不同的培養(yǎng)方式：牙胚細胞條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng)，觀察牙胚細胞對牙髓干細胞生物學活性的影響。結(jié)果顯示：牙髓干細胞在與牙胚細胞條件液培養(yǎng)、分層培養(yǎng)的情況下，可向功能性成牙本質(zhì)細胞譜系分化，誘導分化后的牙髓干細胞團移植至腎被膜下，形成了規(guī)則的牙本質(zhì)牙髓復合體結(jié)構(gòu)。而牙胚細胞與牙髓干細胞混合培養(yǎng)方式不能提供了良好的促增殖、促分化的誘導環(huán)境，以致

5、誘導后的牙髓干細胞不能形成典型的牙本質(zhì)牙髓復合體。 上述結(jié)果提示牙胚細胞與牙髓干細胞非接觸式培養(yǎng)時，所提供的可溶性信號分子，有利于牙髓干細胞的牙向分化、牙本質(zhì)形成；而接觸式培養(yǎng)條件下牙胚細胞分泌的胞外基質(zhì)蛋白以及不溶性表面分子，可能對牙髓干細胞的增殖起抑制作用，進而影響了其牙向分化的可持續(xù)性。 3、牙髓細胞對牙髓干細胞增殖分化的影響為驗證來自成體牙髓細胞的微環(huán)境能否促進牙髓干細胞的增殖、分化，本實驗采用酶消化法結(jié)合組織

6、塊法，獲取原代牙髓細胞，與STRO-1+的牙髓干細胞以三種方式：條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng)進行共培養(yǎng)。結(jié)果表明： 缺少上皮信號的成體微環(huán)境不能有效地誘導牙髓干細胞的牙向分化和形態(tài)發(fā)生，但可明顯促進其增殖活性。提示成體微環(huán)境中缺少促進牙髓干細胞牙向分化的啟動信號，但成體微環(huán)境中生長因子、細胞外基質(zhì)以及細胞表面分子等對牙髓干細胞的促增殖效應明顯。 4、用牙髓干細胞制備嵌合體牙齒為進一步驗證牙胚細胞的誘導作用是來自其中的上皮

7、還是間充質(zhì)成分，本實驗將取自不同個體的大鼠切牙根尖蕾細胞、牙乳頭細胞分別與STRO-1+牙髓干細胞復合形成細胞團重組體，腎被膜下移植，結(jié)果顯示根尖蕾細胞-牙髓干細胞嵌合體在體內(nèi)形成典型的牙冠樣結(jié)構(gòu)；牙乳頭細胞-牙髓干細胞嵌合體形成的含骨樣牙本質(zhì)和牙本質(zhì)牙髓復合體的結(jié)構(gòu)中，PKH26 標記的牙髓干細胞并未直接參與成牙本質(zhì)細胞分化和牙本質(zhì)形成，說明在牙胚細胞誘導牙髓干細胞牙向分化過程中，是牙源性上皮成分起了決定性作用。 在與非牙源

8、性STRO-1+骨髓基質(zhì)干細胞嵌合成牙的比較研究中，我們發(fā)現(xiàn)：根尖蕾細胞能促進骨髓基質(zhì)干細胞向成牙本質(zhì)細胞譜系分化，但根尖蕾細胞-骨髓基質(zhì)干細胞重組體在腎被膜下，僅發(fā)育成不典型的牙本質(zhì)牙髓復合體，無釉質(zhì)形成。提示在嵌合體牙齒研究中，牙源性成體干細胞比非牙源性成體干細胞更具有臨床應用價值。 當牙髓干細胞與根尖蕾細胞按不同比例進行體內(nèi)重組時，我們發(fā)現(xiàn)：上皮細胞與牙髓干細胞的比例可影響嵌合體牙齒的形態(tài)發(fā)生，只有在1:1 細胞比情況下，