脫落乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體用于牙髓再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙髓再生是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，最主要的研究方法是基于組織工程原理，利用間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合生物支架材料進(jìn)行異位和原位的組織重建。目前實(shí)驗(yàn)研究多數(shù)為前瞻性的組織學(xué)和動(dòng)物模型探索，但至今尚未實(shí)現(xiàn)具有完整組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和良好生理功能的牙髓再生。此外由于間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用方式和生物支架的材料性能存在倫理學(xué)限制和生物安全性驗(yàn)證，要進(jìn)行臨床試驗(yàn)應(yīng)用仍需進(jìn)一步深入研究。
　　要真正實(shí)現(xiàn)具有生理功能性牙髓再生的臨床應(yīng)用，種子細(xì)胞的來源、支架材料的選擇以及有

2、效的誘導(dǎo)微環(huán)境是亟待解決的關(guān)鍵問題。脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（SHED）是源于脫落器官的一類處于發(fā)育早期的牙源性干細(xì)胞，具有良好的生物學(xué)性能，包括較高的增殖能力、更為廣泛的多向分化能力、以及良好的免疫調(diào)控能力；并且其臨床來源也更為廣泛，便于自體的組織再生應(yīng)用。此外近年來出現(xiàn)的細(xì)胞聚合體（aggregate）是一種先進(jìn)的組織工程學(xué)技術(shù)，其不但可以保持干細(xì)胞活性，擁有良好性能的生物支架-自分泌的細(xì)胞間基質(zhì)，而且富含細(xì)胞生長和分化所需的誘導(dǎo)因子。本

3、研究擬通過乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體的生物學(xué)性能檢測(cè)、牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體組織再生實(shí)驗(yàn)，明確其用于全牙根牙髓再生的可行性，進(jìn)而利用動(dòng)物模型的治療實(shí)驗(yàn)，探討乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體治療年輕恒牙牙髓壞死的效果，以期為兒童牙體牙髓疾病治療提供新的治療理念和策略，并為臨床試驗(yàn)應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分脫落乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體生物學(xué)性能的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：明確脫落乳牙牙髓干細(xì)胞及其聚合體的生物學(xué)性能。
　　方法：分離和培養(yǎng)人

4、類脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞與恒牙牙髓干細(xì)胞（DPSC），檢測(cè)并比較兩者分子表面標(biāo)記、克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力；進(jìn)而誘導(dǎo)制備SHED細(xì)胞聚合體，通過組織學(xué)、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其生物學(xué)性能。
　　結(jié)果：脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞均能夠陽性表達(dá)間充質(zhì)來源的表面標(biāo)志STRO-1，CD90和CD146，而造血系來源標(biāo)志物CD34為陰性。SHED細(xì)胞在克隆形成能力、增殖水平、成骨成脂分化能力方面均高于DPSC。制備的SHED細(xì)

5、胞聚合體厚度適中、質(zhì)地堅(jiān)韌；HE染色觀察SHED細(xì)胞聚合體含有較多的未分化細(xì)胞以及豐富的細(xì)胞外基質(zhì)；MASSON染色可見交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維。
　　結(jié)論：乳牙牙髓干細(xì)胞及其聚合體具有良好的生物學(xué)性能，是一類理想的種子細(xì)胞和適宜的牙髓再生應(yīng)用方式。
　　第二部分乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體構(gòu)建牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探索SHED細(xì)胞聚合體用于組織工程構(gòu)建牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)方法。
　　方法：收集正畸拔

6、除牙齒，根管清理并制備全長牙根組織支架；實(shí)驗(yàn)組根管內(nèi)植入SHED細(xì)胞聚合體，對(duì)照組根管內(nèi)充填氫氧化鈣糊劑，而后移植裸鼠皮下孵育，術(shù)后3月組織學(xué)取材；獲取根管內(nèi)的再生組織，細(xì)胞分離并培養(yǎng)，對(duì)其表面分子標(biāo)記、克隆形成能力、增殖水平以及成骨成脂分化能力檢測(cè)并與SHED細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比；同時(shí)取材組織脫礦后利用HE、免疫組化染色等方法評(píng)估異位再生情況。
　　結(jié)果：組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的再生組織幾乎充盈整個(gè)根管，類似正常牙髓組織，免疫組化染色可見

7、組織中DSPP、CD31、NESTIN均為陽性表達(dá)，也證明其具有繼發(fā)性牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞層、血管及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)；再生組織細(xì)胞具有與SHED細(xì)胞相同的表面分子標(biāo)記，同時(shí)其克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力均與SHED細(xì)胞相似；免疫熒光染色顯示再生組織的大部分血管及神經(jīng)源于 SHED細(xì)胞分化而來；而對(duì)照組根管內(nèi)可見鈣化團(tuán)塊及肉芽結(jié)締組織的混雜結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：SHED細(xì)胞聚合體在牙根管內(nèi)微環(huán)境中可以異位再生形成正常形態(tài)的牙髓-牙

8、本質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。
　　第三部分乳牙牙髓干細(xì)胞聚合體用于牙髓再生的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　目的：利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)小型豬（mini-pig）乳牙牙髓干細(xì)胞（SPED）細(xì)胞聚合體進(jìn)行原位牙髓再生的應(yīng)用效果。
　　方法：分離和培養(yǎng) Mini-Pig的乳牙牙髓干細(xì)胞，檢測(cè)和分析其細(xì)胞生物學(xué)行為，進(jìn)而誘導(dǎo)制備 SPED細(xì)胞聚合體；建立年輕恒牙牙髓壞死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，設(shè)置 SPED聚合體再生組、傳統(tǒng)根尖誘導(dǎo)成形治療組和正常牙髓對(duì)照組；術(shù)

9、后4月進(jìn)行受試牙齒牙髓活力反應(yīng)測(cè)試，而后常規(guī)組織學(xué)取材，利用HE、免疫組化、免疫熒光染色等方法觀察牙髓再生和牙根尖形成情況。
　　結(jié)果：放射學(xué)檢查顯示 SPED聚合體再生組牙根繼續(xù)發(fā)育，并且對(duì)機(jī)械刺激出現(xiàn)牙髓疼痛反應(yīng)；組織學(xué)HE染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)再生組受試牙齒牙根繼續(xù)發(fā)育并形成正常的根尖形態(tài)，此外全長根管內(nèi)可見類牙髓結(jié)構(gòu)的再生組織；免疫組化和熒光染色可見組織中CD31、Nestin、CGRP、TRPV1、TRPM8表達(dá)陽性細(xì)胞的規(guī)則分布