毛囊源性干細(xì)胞成牙能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙齒的發(fā)生和發(fā)育是在上皮-間充質(zhì)相互作用的精確調(diào)控下完成的，這也提示我們在選擇種子細(xì)胞的時(shí)候也必須同時(shí)考慮兩種細(xì)胞，即上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。目前發(fā)現(xiàn)的有望應(yīng)用于牙組織工程的細(xì)胞大部分源自牙本身，如牙髓干細(xì)胞與脫落乳牙牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞等。在非牙源性成體干細(xì)胞方面，目前僅發(fā)現(xiàn)骨髓來源的細(xì)胞具有成牙潛能，而且必須依靠胚胎期的誘導(dǎo)條件才能分化為牙齒形成細(xì)胞。利用非牙源性細(xì)胞實(shí)現(xiàn)牙齒再生面臨種子細(xì)胞匱乏、誘導(dǎo)條件短缺的窘

2、境，而在成體中尋找適用于釉質(zhì)再生的干細(xì)胞一直都是牙齒再生的瓶頸問題。毛囊是近年來干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，毛囊中包含上皮和間充質(zhì)兩種來源的干細(xì)胞。本研究從成體干細(xì)胞可塑性和干細(xì)胞定向分化微環(huán)境兩個(gè)方面入手，探討利用毛囊來源的干細(xì)胞進(jìn)行牙齒再生的可能性，得出的主要結(jié)論如下：
　　1.毛囊真皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與干細(xì)胞生物學(xué)特性研究
　　采用酶消化聯(lián)合機(jī)械分離的方法成功在體外培養(yǎng)了具有較強(qiáng)增殖能力和克隆形成能力的毛囊真皮鞘細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞。

3、通過對其可塑性的研究證實(shí)真皮鞘細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞中包含具有多向分化能力的干細(xì)胞。但是這些干細(xì)胞具有異質(zhì)性，缺乏特異性表面標(biāo)志物，難以有效分選。而含有干細(xì)胞的混雜細(xì)胞可以用來進(jìn)行干細(xì)胞定向分化研究，未經(jīng)純化的毛囊真皮細(xì)胞在成脂、成骨誘導(dǎo)條件下，其中的所包含的干細(xì)胞表現(xiàn)出成脂和成骨潛能。在相同的成骨誘導(dǎo)條件下，毛乳頭細(xì)胞的堿性磷酸酶活性比真皮鞘細(xì)胞更強(qiáng)，因此可能更適用于硬組織再生。
　　2.毛乳頭間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞
　

4、　在出生后小鼠下頜切牙根尖蕾牙胚細(xì)胞與毛乳頭間充質(zhì)干細(xì)胞混合共培養(yǎng)體系中，來自根尖蕾上皮的成牙信號能夠促使毛乳頭間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，說明誘導(dǎo)非牙源性干細(xì)胞成牙的微環(huán)境可以脫離發(fā)育早期牙胚的限制。在根尖蕾牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，毛乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞周期明顯改變并表達(dá)Dspp和Dmp1基因，說明來自根尖蕾細(xì)胞的上皮信號也能啟動(dòng)毛乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的牙向分化。
　　3.毛乳頭間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)研究<

5、br>　　為了研究利用非牙源性干細(xì)胞在脫離牙胚組織的條件下構(gòu)建組織工程牙齒的可能性，我們將把經(jīng)過根尖蕾牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的毛乳頭間充質(zhì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行體內(nèi)移植后，僅形成骨樣組織。我們將根尖蕾牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液結(jié)合到脫蛋白牙本質(zhì)片制成的支架材料上，種子細(xì)胞以細(xì)胞團(tuán)的形式與支架材料進(jìn)行復(fù)合后體內(nèi)移植。取材結(jié)果顯示，在結(jié)合在支架材料上的條件培養(yǎng)基的作用下，對照組的牙髓干細(xì)胞可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，規(guī)則地排列在支架材料表面，并且形成管狀牙本質(zhì)。毛

6、乳頭細(xì)胞只在支架材料表面形成少量無定形基質(zhì)。這一結(jié)果也說明僅僅依靠信號分子的作用不能實(shí)現(xiàn)非牙源性細(xì)胞分化為成熟的成牙本質(zhì)細(xì)胞。
　　4.毛囊表皮干細(xì)胞應(yīng)用于釉質(zhì)再生的可能性
　　利用組織塊法成功了培養(yǎng)毛囊上段的外根鞘細(xì)胞，這些細(xì)胞的自我更新能力強(qiáng)，呈克隆樣生長，表達(dá)表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志物β1整合素和角蛋白19，具有典型的表皮干細(xì)胞特征。在此基礎(chǔ)上，我們利用E17胎鼠下頜第一磨牙牙乳頭和出生后7天C57BL/6GFP小鼠下頜切

7、牙根尖蕾間充質(zhì)，分別與E17胎鼠表皮和體外培養(yǎng)的毛囊表皮干細(xì)胞進(jìn)行重組，結(jié)果顯示，E17胎鼠下頜第一磨牙牙乳頭與生后7天C57BL/6GFP小鼠下頜切牙根尖蕾間充質(zhì)均具有誘導(dǎo)E17胎鼠表皮分化為成釉細(xì)胞的能力，但是沒有充分的證據(jù)表明體外培養(yǎng)的毛囊表皮干細(xì)胞在這兩種誘導(dǎo)條件下可以分化為成釉細(xì)胞。
　　綜上所述，本研究首次證實(shí)了毛乳頭間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠下頜切牙根尖蕾上皮信號的誘導(dǎo)下能夠分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，但是仍無法在脫離牙胚組織的條件