利用人毛囊干細(xì)胞構(gòu)建組織工程表皮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立毛囊外根鞘細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法；探討應(yīng)用Ⅳ型膠原差速貼壁法在體外分選人毛囊干細(xì)胞中的作用；完善毛囊干細(xì)胞的培養(yǎng)和大量擴(kuò)增體系，并鑒定。最終利用毛囊干細(xì)胞一殼聚糖明膠材料(CGM)進(jìn)行修復(fù)裸鼠皮膚缺損的探索性研究。 方法：分離得到單個(gè)毛囊后，采用組織塊法和消化法進(jìn)行毛囊外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)做細(xì)胞生長曲線；將人毛囊外根鞘細(xì)胞接種在Ⅳ型膠原涂被的培養(yǎng)皿上粘附分選，20分鐘后將未粘附細(xì)胞作為對(duì)照組，粘

2、附細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，兩組細(xì)胞分別進(jìn)行K15、β-1整合素和外皮蛋白免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。并觀察超微結(jié)構(gòu)和測(cè)定克隆形成率；利用中性蛋白酶分離毛囊干細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)行大量擴(kuò)增，培養(yǎng)至P12后觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并用免疫組織化學(xué)、克隆形成率和RT-PCR進(jìn)行鑒定；將體外擴(kuò)增培養(yǎng)的毛囊干細(xì)胞接種于CGM，構(gòu)建組織工程表皮膜片，并用來修復(fù)裸鼠背部的全層皮膚缺損。 結(jié)果：組織塊法和消化法均能培養(yǎng)毛囊外根鞘細(xì)胞，組織塊法細(xì)胞生長慢，不易匯合

3、，消化法細(xì)胞增殖快；Ⅳ型膠原涂被的培養(yǎng)皿上20分鐘粘附率約22％。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組K15、β-1整合素及外皮蛋白的表達(dá)有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞小，核漿比例大，細(xì)胞器不成熟，細(xì)胞表面的微絨毛較長而密，克隆形成率高于對(duì)照組(P<0.05)，克隆形成大，表現(xiàn)為干細(xì)胞的特征；毛囊干細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上生長良好，培養(yǎng)至12代檢測(cè)，免疫組化染色均表達(dá)K15、β1-整合素及P63，PO至P12均表達(dá)K15 mRNA，但克隆形成率逐漸降低，毛囊干細(xì)胞在

4、CGM上生長良好。毛囊干細(xì)胞一CGM修復(fù)裸鼠后1周切片示創(chuàng)面有新生上皮覆蓋，表皮分化良好，而對(duì)照組殘留較大未愈創(chuàng)面。修復(fù)后一月和三月可見對(duì)照組收縮較實(shí)驗(yàn)組顯著。 結(jié)論：消化法適合毛囊外根鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)，為進(jìn)一步分離純化培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)；利用Ⅳ型膠原差速貼壁法可初步分選、純化人毛囊干細(xì)胞；通過在飼養(yǎng)層上接種毛囊干細(xì)胞，結(jié)合傳代過程中中性蛋白酶消化可大量擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞；體外構(gòu)建的毛囊干細(xì)胞-CGM復(fù)合物能修復(fù)裸鼠皮膚缺損