應(yīng)用表皮干細(xì)胞及脫細(xì)胞真皮構(gòu)建組織工程皮膚及其移植實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)(燒)傷等多種原因造成的皮膚大面積缺損可導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體功能障礙甚至危及生命。目前修復(fù)皮膚缺損的方法主要是用自體皮膚移植。但在治療大面積深度燒傷等皮膚缺損時，由于缺乏供皮區(qū)，皮源不足，往往給創(chuàng)面覆蓋造成困難。為反復(fù)供皮的需要，目前臨床應(yīng)用的植皮術(shù)，諸如郵票狀植皮術(shù)、網(wǎng)狀皮膚植皮術(shù)、異體皮嵌植自體小皮片混合移植術(shù)、微粒皮移植術(shù)以及自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植術(shù)等方法，均不同程度地缺乏真皮成分，因而不能滿意解決愈后外觀和功能問題。然而如果增加供皮的

2、厚度，勢必會影響供皮區(qū)的正常愈合。為解決這一難題，目前用組織工程學(xué)方法研制了許多皮膚代用品，但臨床效果尚不穩(wěn)定。因此，構(gòu)建一種功能理想的永久性皮膚替代品具有很重要的臨床意義和應(yīng)用價值。 目的 利用組織工程學(xué)原理，我們期望通過體外分離擴(kuò)增人表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，自行制備異種(豬)脫細(xì)胞真皮支架作為基質(zhì)材料h探討體外構(gòu)建組織工程皮膚的可行性。并將該組織工程皮膚移植于動物創(chuàng)面，探討該組織工程皮膚修復(fù)全層皮膚缺損的可行性。 方

3、法 通過酶消化法，分離小兒包皮的表皮與真皮層，表皮制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'6>／ml，接種于包被好Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中快速粘附10～15min(37℃)，棄去未粘附細(xì)胞，保留快速粘附細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。以高糖低鈣的DMEM培養(yǎng)基，補(bǔ)充100g／L的干細(xì)胞培養(yǎng)專用胎牛血清(FBS)，0.05mmol／L CaCl<,2>，10ng/ml表皮生長因子，10<'-6>mol／L氫化可的松進(jìn)行培養(yǎng)。對傳代后擬接種的種子細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞

4、儀α<,6>、CD<,71>表型鑒定，角蛋白19免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定以及形態(tài)學(xué)觀察等。我們以NaCl-SDS-胰蛋白酶法制備脫細(xì)胞真皮，并進(jìn)行組織學(xué)觀察。將分離培養(yǎng)傳代的表皮干細(xì)胞接種于鋪好Ⅳ型膠原的脫細(xì)胞真皮表面，加入干細(xì)胞培養(yǎng)體系，先置于培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，再行氣液界面培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚。對構(gòu)建的組織工程皮膚進(jìn)行組織學(xué)觀察。將構(gòu)建的組織工程皮膚移植于大鼠全層創(chuàng)面，以單純脫細(xì)胞真皮移植作對照。對移植后創(chuàng)面進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)觀察、抗人HL

5、A—I免疫熒光染色及廣譜角蛋白染色。 結(jié)果1、黏附的細(xì)胞接種在已包被好Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中后很快貼壁，第3-4d形成一些小集落。其后細(xì)胞逐漸增殖，至第1Od左右逐漸有大集落形成。而未黏附的細(xì)胞貼壁遲，整個生長過程中未見大集落形成。黏附細(xì)胞K<,19>免疫化學(xué)染色陽性，α<,6><'bri>CD<,71><,dim>細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的40％左右。黏附細(xì)胞具有表皮干細(xì)胞特性。2、制備的無細(xì)胞異種真皮呈乳白色，柔軟而有彈性，光鏡下見表皮完

6、全去除，真皮內(nèi)無任何細(xì)胞成分，未見細(xì)胞碎屑、毛囊、汗腺或血管結(jié)構(gòu)。膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，排列有序。3、表皮干細(xì)胞種植于脫細(xì)胞真皮上后，細(xì)胞便迅速貼壁。體外聯(lián)合培養(yǎng)約兩周后，可融合形成復(fù)合皮。復(fù)合皮H E染色，光鏡下可見組織工程皮底層為規(guī)則的纖維結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞真皮表面覆蓋多層融合的表皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間連接緊密。表皮層結(jié)構(gòu)與脫細(xì)胞真皮基底黏附牢。4、復(fù)合皮移植于大鼠創(chuàng)面后，皮片愈合良好，未見排斥反應(yīng)，無色素沉著，創(chuàng)面略有收縮；移植后4周，創(chuàng)

7、面切片光鏡下見表皮層含多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，創(chuàng)面愈合，膠原排列整齊，真皮組織內(nèi)見少許炎性細(xì)胞浸潤。組織工程皮膚移植組抗人HLA—I免疫熒光染色，表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，說明組織工程皮膚移植后創(chuàng)面愈合的表皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)來源于復(fù)合皮中接種的細(xì)胞。組織工程皮移植組廣譜角蛋白染色見表皮全層結(jié)構(gòu)內(nèi)胞漿染成棕黃色，成陽性反應(yīng)，說明復(fù)合皮移植后創(chuàng)面被覆一表皮層結(jié)構(gòu)，創(chuàng)面愈合。脫細(xì)胞真皮組始終無表皮結(jié)構(gòu)形成，表面逐漸干燥、變硬，周邊翹起；最終與創(chuàng)面脫離而創(chuàng)面暴露，至4周

8、時創(chuàng)面仍未愈合。脫細(xì)胞真皮移植組術(shù)后兩周，光鏡下未見表皮層結(jié)構(gòu)形成，創(chuàng)面處可見炎性細(xì)胞浸潤，創(chuàng)面未愈合。脫細(xì)胞真皮移植組抗人H L A—I免疫熒光染色反應(yīng)陰性。 結(jié)論1、我們采用NaCl-SDS-胰蛋白酶法制備的脫細(xì)胞真皮，可完全去除表皮層及真皮內(nèi)各種細(xì)胞成分，膠原纖維結(jié)構(gòu)保存完好，無斷裂，排列有序。 2、Ⅳ型膠原差速黏附法可用來分選和純化表皮干細(xì)胞。以Ⅳ型膠原鋪底，輔以高糖低鈣的DMEM培養(yǎng)基，以及適合干細(xì)胞生長的專用