應用脂肪干細胞與脫細胞真皮構建組織工程皮膚.pdf

1、研究目的： 探索脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向表皮細胞定向分化的誘導培養(yǎng)方法，分析ADSCs誘導分化的表皮細胞是否具有干細胞的特性。 觀察人脫細胞真皮的超微結構特點，分析其做為組織工程皮膚支架材料的合理性。探索應用ADSCs源類表皮干細胞復合脫細胞真皮體外構建組織工程皮膚的方法，觀察該組織工程皮膚的組織結構特點與超微結構特點。 應用構建的組織工程皮膚修復實驗動物皮

2、膚缺損，觀察治療效果與成活后的組織結構特點和超微結構特點。 研究方法： 1、采用貼壁分離方法從脂肪抽吸液中分離出脂肪干細胞，培養(yǎng)擴增。在表皮細胞誘導培養(yǎng)基中誘導ADSCs向表皮細胞定向分化。分別檢測誘導前、后細胞的表面抗原表型，細胞周期與CK5、CK10、CK19表達情況，并繪制細胞增殖曲線。在成骨細胞誘導培養(yǎng)基中進一步誘導ADSCs源表皮細胞向成骨細胞定向分化，對誘導后的細胞進行ALP染色和Von Kossa染色檢查。

3、 2、掃描電鏡下觀察人脫細胞真皮的超微結構。應用人ADSCs源類表皮干細胞復合人脫細胞真皮體外構建組織工程皮膚，對其進行組織學觀察與超微結構觀察。 3、應用組織工程皮膚和脫細胞真皮修復裸鼠皮膚缺損，術后觀察皮膚缺損修復情況，對移植成活的組織工程皮膚進行基底膜糖原(PAS)染色檢查和組織學觀察，對DAPI標記的人ADSCs源類表皮干細胞進行示蹤觀察。 4、應用實驗豬自體ADSCs源類表皮干細胞復合豬脫細胞真皮構建

4、組織工程皮膚，修復其背部正中線左側皮膚缺損。以豬脫細胞真皮修復右側皮膚缺損做為對照。術后觀察皮膚缺損修復情況，對移植成活的組織工程皮膚進行組織學觀察和超微結構觀察。 研究結果： 1、ADSCs向表皮細胞誘導分化，72小時后部分細胞由梭形變成圓形或橢圓形，7天后大部分細胞呈圓形或橢圓形，排列成鋪路石狀。誘導培養(yǎng)前、后的細胞增殖曲線均呈S型，但是誘導培養(yǎng)前ADSCs 7d時增殖達到頂峰，誘導培養(yǎng)后的細胞6d時增殖達到頂峰。誘

5、導培養(yǎng)前87.42％的細胞處于G<,0>和G<,1>期，誘導培養(yǎng)后96.38％的細胞處于G<,0>和G<,1>期。誘導培養(yǎng)后，少數(shù)細胞CK5免疫熒光染色呈陽性，部分細胞CK19免疫熒光染色呈陽性，CK19在mRNA水平的表達呈陽性。誘導培養(yǎng)后傳代lO次的細胞CKlO、CKl9在mRNA水平的表達呈陽性。誘導培養(yǎng)后傳代10次的細胞形態(tài)無明顯改變，X-Gal染色呈陰性，細胞染色體數(shù)目2n=46，核型為女性正常核型(46，xx)。裸鼠皮下注射

6、誘導培養(yǎng)后傳代10次的細胞，2個月后無瘤體形成。ADSCs源表皮細胞向成骨細胞誘導分化后，ALP染色和Von Kossa染色顯示為陽性。 2、人脫細胞真皮基底膜面與真皮面均為多孔結構，基底膜孔隙直徑為31.03～82.76um(51.72±15.64um)，真皮孔隙直徑為115.38～192.31um(143.27±23.95tum)。對體外培養(yǎng)3天的組織工程皮膚進行掃描電鏡觀察，可見大量人ADSCs源類表皮干細胞粘附于脫細胞真

7、皮基底膜上，細胞呈圓形、橢圓形，直徑為75.62～107.86tlm(87.11±11.46um)，顯著小于脫細胞真皮基底膜孔隙直徑。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)2周的組織工程皮膚與正常皮膚的組織結構特征相似，僅缺少角質(zhì)層。 3、術后1個月，實驗組裸鼠背部移植的組織工程皮膚成活良好，但表皮較薄弱，色澤與周圍正常皮膚相似。PAS染色可見表皮層和真皮層之間有呈深紅染色、呈波浪狀連續(xù)存在的基底膜。術后2個月，光鏡下可見組織工程皮膚的結構與

8、正常皮膚相似，真皮內(nèi)無表皮樣囊腫。應用DAPI標記人ADSCs源類表皮干細胞進行示蹤觀察，術后1個月可見表皮深層有2～3層較強熒光顯色的細胞，術后2個月可見表皮深層有5～6層較弱熒光顯色的細胞。對照組裸鼠術后1個月時背部創(chuàng)面未愈合，仍覆蓋薄層痂皮，創(chuàng)緣輕度收縮。 4、術后1個月，實驗豬背部正中線左側移植的組織工程皮膚成活良好，表皮角化明顯，色素缺失；正中線右側移植的豬脫細胞真皮形成肉芽組織，局部結痂，創(chuàng)緣收縮明顯。組織學觀察可

9、見，實驗側組織工程皮膚的結構與正常皮膚相似，真皮內(nèi)無表皮樣囊腫，表皮層與真皮層之間可見呈犬牙交錯樣相接的表皮突和真皮乳頭；對照側豬脫細胞真皮則轉(zhuǎn)化為肉芽組織，其表面無表皮層覆蓋。超微結構觀察可見，在成活的組織工程皮膚基底膜與基底層細胞之間有半橋粒連接形成；表皮細胞的胞質(zhì)中有角蛋白絲，成束狀排列；相鄰的表皮細胞之間形成橋粒連接。 研究結論 1、ADSCs具有易于獲取，能夠在體外大規(guī)模培養(yǎng)和擴增，性質(zhì)穩(wěn)定，多潛能分化，培養(yǎng)擴

10、增不需要大量的血清等優(yōu)點，是組織工程研究中良好的種子細胞來源。 2、ADSCs在體外誘導培養(yǎng)體系中能夠向表皮細胞分化，部分細胞具備了表皮干細胞的一些特征，我們將其暫時命名為“ADSCs源類表皮干細胞”。ADSCs源類表皮干細胞在實驗動物體內(nèi)能夠復層生長，形成表皮樣結構。 3、本研究中，誘導ADSCs向表皮細胞分化的體外誘導培養(yǎng)體系具有安全性。 4、脫細胞真皮基底膜具有良好的細胞粘附性?；啄づc真皮均為多孔結構，基

11、底膜和真皮的孔隙直徑接近于支架材料促進表皮組織和真皮組織再生的最佳孔隙直徑。 5、脫細胞真皮的結構特點有利于移植部位周圍的成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞移行進入并增殖，體外構建組織工程皮膚時不需在真皮層內(nèi)復合成纖維細胞。這既降低了構建組織工程皮膚的復雜性和經(jīng)濟成本，同時還提高了安全性。 6、本研究中構建的組織工程皮膚具有生物活性，移植于實驗動物體內(nèi)后能夠轉(zhuǎn)化為組織結構合理的皮膚組織，未觀察到表皮樣囊腫形成。 7、本研究