脂肪干細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞復(fù)合小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程口腔黏膜用于犬尿道重建的實驗研究.pdf

1、各種原因造成的尿道狹窄、尿道缺損仍然是泌尿外科的難題之一,臨床上多采用包皮皮瓣、陰囊皮瓣、口腔黏膜、結(jié)腸黏膜等來重建尿道,其中,口腔黏膜是近年來廣泛應(yīng)用的修復(fù)材料,尤其是舌粘膜,近年來在臨床上被廣泛應(yīng)用且大量的臨床結(jié)果表明修復(fù)效果良好。但口腔黏膜存在取材部位并發(fā)癥、取材量受限等問題。組織工程技術(shù)的快速發(fā)展,為尿道重建提供了新的方法。本研究探討應(yīng)用脂肪于細(xì)胞、口腔上皮細(xì)胞復(fù)合小腸粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程口腔黏膜來重建尿道的可行性,以

2、期為尿道的修復(fù)重建提供新的選擇。全文共分四章:
　　第一章種子細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　1、目的：
　　探討犬脂肪干細(xì)胞(adipose derired stem cell,ADSC)、口腔上皮細(xì)胞(oralkeratinocyte,OK)分離、體外培養(yǎng)增殖及鑒定方法。
　　2、材料和方法：
　　應(yīng)用膠原酶消化法分離培養(yǎng)犬ADSC,利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志(CD29,CD34,CD44,CD45,CD90

3、和CD105)。
　　應(yīng)用DispaseⅡ分離犬口腔上皮層,胰酶消化分離獲得犬OK,在i3T3滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)增,免疫熒光檢測細(xì)胞AE1/AE3的表達(dá),獲得足量細(xì)胞后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面AE1/AE3的表達(dá)率。
　　3、結(jié)果：
　　原代培養(yǎng)2 d后可見ADSC貼壁生長,約5天左右細(xì)胞融合可達(dá)80-90％,可傳代培養(yǎng)。顯微鏡下見ADSC呈紡錘形,少數(shù)有突起,為不規(guī)則狀。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果CD29、CD44、CD90

4、、CD105的表達(dá)均成陽性,CD34、CD45表達(dá)為陰性。
　　OK原代培養(yǎng)3天后可見貼壁生長,約15天左右細(xì)胞融合達(dá)到80-90％。顯微鏡下見OK呈多角形,細(xì)胞融合后呈典型的“鋪路右”狀外觀。傳代后將P1 OK接種至絲裂霉素滅活的3T3(i3T3)培養(yǎng)基培養(yǎng)、擴(kuò)增,可見OK細(xì)胞呈集落樣生長,約6天細(xì)胞融合達(dá)90-95％。流式細(xì)胞儀檢測P3 OK AE1/AE3表達(dá)率為89.2％。
　　4、結(jié)論：
　　利用膠原酶消化法

5、可獲得大量的ADSC,來源廣泛,獲取簡單,并且創(chuàng)傷小。ADSC形態(tài)與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,均呈紡錘形,因此很難從形態(tài)上來區(qū)分兩者。我們采用了流式細(xì)胞技術(shù)對ADSCI進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明CD29、CD44、CD90、CD105的表達(dá)均陽性,CD45、CD34表達(dá)為陰性。此結(jié)果與國內(nèi)外報道ADSC表面標(biāo)志相符。
　　DispaseⅡ能將犬口腔上皮表皮層脫離,將表皮層粉碎后用胰酶消化,能獲得大量OK,方法簡單,創(chuàng)傷小。OK呈扁平、多邊形,形

6、狀不規(guī)則,細(xì)胞融合后呈典型的“鋪路石”狀外觀。細(xì)胞生長緩慢,2-3代后即衰老變性。在i3T3培養(yǎng)基上,OK表現(xiàn)出旺盛的增殖力,細(xì)胞生長迅速,能保持7-8代穩(wěn)定增殖。流式細(xì)胞檢測表明,P3 OK中AE1/AE3表達(dá)率達(dá)到89.2％。
　　第二章體外共培養(yǎng)環(huán)境對ADSC,OK細(xì)胞移行速率、增殖速率的影響
　　1、目的：
　　通過檢測ADSC和OK在體外共培養(yǎng)患者中的移行速率、增殖速率來評估二細(xì)胞的相容性。
　　2、方

7、法：
　　將等量的ADSC和oK接種至同一個刻度培養(yǎng)皿中,觀測共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞的移行速率,與單獨培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞移行速率作對比,探討共培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞移行速率的影響。
　　將ADSC和OK的培養(yǎng)上清分別加入對方的培養(yǎng)液中(條件培養(yǎng)基),行MTT檢測,觀測模擬共培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞的增殖速率,與常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞增殖速率作對比,探討共培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞增殖速率的影響。
　　3、結(jié)果：
　　ADSC的移行速率由單獨培養(yǎng)環(huán)境下的0.

8、8-5.5mm/d提高至共培養(yǎng)環(huán)境下的0.8-6.8mm/d,OK的移行速率由單獨培養(yǎng)環(huán)境下的0-1.5mm/d提高至共培養(yǎng)環(huán)境下的0.2-2.5mm/d。MTT法檢測細(xì)胞的增殖速率表明,與常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境相比,條件培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境下ADSC和OK的增殖速率均得以提高。
　　4、結(jié)論：
　　體外共培養(yǎng)環(huán)境下,ADSC和OK的移行速率均能得以明顯提高。在模擬共培養(yǎng)環(huán)境的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境下,ADSC和OK的增殖率也明顯提高。ADSC

9、和OK在體外共培養(yǎng)環(huán)境下呈現(xiàn)互相促進(jìn)、協(xié)同增殖態(tài)勢。
　　第三章小腸粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)(SIS)的制備、與ADSC和OK體外構(gòu)建組織工程口腔粘膜的試驗研究
　　1、目的：
　　探討SIS的生物相容性,以及與ADsC和OK體外構(gòu)建組織工程口腔粘膜的可行性。
　　2、方法：
　　將豬小腸清洗后,鈍性去除粘膜層和漿肌層,獲得小腸粘膜下層,以1％的Triton-X100與0.1％NH3H2O脫細(xì)胞,以1:1的甲醇/

10、氯仿脫脂處理,反復(fù)沖洗后行凍干,密封包裝后以25kGy的劑量行Co50輻照滅菌。將所得的SIS行旺染色、Masson染色觀察有無細(xì)胞殘留及膠原纖維形態(tài),掃描電鏡觀察材料表面的纖維分布和表面特點。將SIS浸泡于DMEM培養(yǎng)液中1周,取浸泡DMEM液培養(yǎng)ADSC,繪制生長曲線,觀測SIS浸泡液對細(xì)胞增殖速率的影響,以此評估SIS的生物相容性。
　　將ADSC種植到SIS上,3天后將ADSC-SIS翻轉(zhuǎn)置于不銹鋼網(wǎng)上,反面種植OK,用混

11、合培養(yǎng)基在液-氣平面培養(yǎng)OK-SIS-ADSC復(fù)合物7天,行掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的生長,HE染色觀察該組織工程復(fù)合物的組織學(xué)特點,與OK-SIS作對比,觀察ADSC的存在對新生上皮的影響。
　　3、結(jié)果：
　　HE染色和Masson染色表明所得SIS無細(xì)胞殘留,保持完整的膠原纖維成分。掃描電鏡下SIS表面膠原纖維呈現(xiàn)裂隙樣結(jié)構(gòu),利于細(xì)胞的黏附、長入。MTT檢測表明SIS浸泡液不對ADSC的增殖曲線產(chǎn)生影響,表明sIs生物

12、相容性良好。
　　掃描電鏡結(jié)果表明,ADSC和OK均能在SIS表面良好黏附、生長。HE染色表明,與OK-SIS對比,OK-SIS-ADSC復(fù)合物表面上皮層結(jié)構(gòu)更為致密、更為厚,上皮層形態(tài)更好。
　　4、結(jié)論：
　　SIS生物相容性良好,OK和ADSC均能在其表面良好生長。ADSC的存在利于體外培養(yǎng)環(huán)境下新上皮層的形成,利用SIS、OK和ADSC體外構(gòu)建組織工程口腔黏膜是切實可行的。
　　第四章組織工程化OK-SI

13、S-ADSC復(fù)合物用于犬尿道重建的實驗研究
　　1、目的：
　　探討組織工程化OK-SIS-ADSC復(fù)合物在尿道重建中的應(yīng)用前景。
　　2、方法：
　　分別采用單純的SIS及組織工程化OK-SIS-ADSC復(fù)合物對雌性Beagle犬行5cm長尿道黏膜替代修補(bǔ),剝除5cm尿道黏膜后,將修復(fù)材料縫合于尿道床上,與兩端正常尿道黏膜縫合,留置8號導(dǎo)尿管。術(shù)后3周拔除導(dǎo)尿管,在術(shù)后5、9、13、17、21、25周進(jìn)行尿道造

14、影,25周后行組織學(xué)檢測。
　　3、結(jié)果：
　　SIS重建尿道組術(shù)后5周尿道造影顯示修復(fù)段發(fā)生尿道狹窄,該組1只犬在術(shù)后7周死于尿潴留繼發(fā)感染。OK-SIS-ADSC復(fù)合物重建尿道組3只犬均良好成活至試驗結(jié)束,各時間點尿道造影均顯示修復(fù)段尿道保持通暢。術(shù)后25周取材組織學(xué)染色表明修復(fù)段形成復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)。
　　4、結(jié)論：
　　利用SIS、OK和ADSC構(gòu)建組織工程化OK-SIS-ADSC復(fù)合物能夠成功管狀修復(fù)犬5c