口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)與溫度敏感性支架材料研制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、作為一種來源充足、具有良好生理學(xué)活性、能有效避免排斥反應(yīng)的角膜替代物,組織工程角膜已成功地應(yīng)用于多種損傷修復(fù),其中角膜上皮的構(gòu)建對(duì)于角膜緣干細(xì)胞缺乏患者的治療具有指導(dǎo)意義。支架材料的應(yīng)用與種子細(xì)胞的選擇對(duì)于組織工程技術(shù)至關(guān)重要,如何利用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有良好生物學(xué)活性、發(fā)揮正常生理功能的組織工程角膜,具有重要的探索價(jià)值與臨床實(shí)際應(yīng)用意義。支架材料是細(xì)胞增殖的場(chǎng)所,同時(shí)引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng),決定著所構(gòu)建組織的形態(tài)。隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展,人工

2、合成智能高分子材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已越來越廣泛。聚N-異丙基丙烯酰胺是一種快速溫度敏感型智能高分子,由于其對(duì)外界微小溫度刺激能引起微觀結(jié)構(gòu)迅速而可逆的變化,使得上皮層與材料層之間得以順利脫離,因而避免了移植后材料的生物降解問題,形成了“無載體”的支架材料。口腔黏膜取材方便,來源豐富,而且口腔黏膜上皮中廣泛分布著干細(xì)胞,體外擴(kuò)增能力較強(qiáng),因此,利用口腔黏膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行眼表重建成為研究熱點(diǎn)。
　　本研究分為兩部分:第一部

3、分?jǐn)M應(yīng)用聚N-異丙基丙烯酰胺接枝于聚苯乙烯膜,制備具有溫度敏感性的支架材料,了解其生物學(xué)性能;第二部分?jǐn)M利用兔口腔黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),了解其擴(kuò)增規(guī)律。為進(jìn)一步利用口腔黏膜上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞,溫度敏感性材料為支架材料,修復(fù)角膜上皮缺損奠定基礎(chǔ),為臨床上治療角膜緣干細(xì)胞缺損的患者提供新的思路。
　　第一部分：溫度敏感性支架材料的研制
　　[目的]：通過研制溫度敏感性高分子共聚膜,了解其化學(xué)特性,為進(jìn)一步應(yīng)用“無載體”支架材

4、料進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]：以電子束為輻射源,將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)接枝到聚苯乙烯(PS)膜上,制得PS-g-NIPAAm二元共聚物。通過稱重測(cè)定聚合反應(yīng)的接枝率:以紅外光譜儀測(cè)定共聚物的化學(xué)組成;以接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定共聚物的親/疏水性;以差熱分析儀測(cè)定共聚物的相轉(zhuǎn)變溫度(LCST);測(cè)定不同環(huán)境溫度下(25～45℃)共聚物膜的溶脹比,得到其脫溶脹和再溶脹的動(dòng)力學(xué)曲線,明確共聚物膜的溶脹性能;以電子顯微鏡觀

5、察聚合膜的超微結(jié)構(gòu)。
　　[結(jié)果]：PS-g-NIPAAm共聚物膜接枝率為39.2％,紅外光譜儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)約1650cm-1處出現(xiàn)氨基與羰基的重疊峰,均證明NIPAAm已接枝在PS膜上。共聚物膜的接觸角為46.9°,證明疏水的PS膜接枝NIPAAm后具有親水性。共聚物的LCST為35℃左右,在LCST以下溶脹,其溶脹率比可高達(dá)干膜的十倍左右,在LCST以上發(fā)生脫溶脹而收縮,變得幾乎與干膜一樣。電子顯微鏡下,NIPAAm廣泛分布于PS

6、膜上。
　　[結(jié)論]：PS-g-NIPAAm共聚膜具有良好的溫度敏感性與溶脹性能,為“無載體”支架材料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　第二部分：口腔黏膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　[目的]：通過體外培養(yǎng)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞,掌握其擴(kuò)增規(guī)律,為進(jìn)一步利用口腔黏膜上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞重建角膜上皮奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]：取新西蘭白兔口腔黏膜組織小塊,用Dispase分離后經(jīng)胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液,接種后靜置培養(yǎng),定期換液。

7、以相差顯微鏡每日動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)增殖情況,行常規(guī)組化染色,并通過透射電鏡,觀察其超微結(jié)構(gòu)。測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及克隆形成率,了解細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律及其增殖能力。
　　[結(jié)果]：生長(zhǎng)良好的口腔黏膜上皮細(xì)胞為卵圓形,細(xì)胞連接成片呈鋪路石狀,胞核較大,無異常核分裂相。透射電鏡下,上皮細(xì)胞核大呈圓形或卵圓形,胞質(zhì)內(nèi)可見正常細(xì)胞器,胞漿內(nèi)含大量的張力纖維,呈網(wǎng)狀或束狀排列,細(xì)胞表面有許多微絨毛。細(xì)胞接種后第1～4天為靜止生長(zhǎng)期,第6～1