脂肪干細胞與PLCL-P123靜電紡納米材料構建組織工程皮膚促創(chuàng)面愈合的研究.pdf

1、目的：
　　對于嚴重燒傷、機械傷致大面積的皮膚組織缺損的治療一直來是整形外科創(chuàng)面愈合研究領域的難點。目前臨床上常采用自體皮瓣或皮片移植來修復，但是由于自體皮瓣或皮片的組織量有限，尚無法滿足臨床的應用。臨床上常采用人工皮膚或者異體皮膚來修復。異體皮供應有限，故人們把眼光聚焦于人工皮膚。近年組織工程技術的進步，采用組織工程皮膚來修復大面積皮膚缺損得到大家認同。對于組織工程皮膚目前研究較多，但尚未找到一種理想的人工皮膚。因此探索一種接近

2、正常皮膚結構和生理特性的皮膚替代物成為必要。
　　納米技術為新型仿生生物活性材料的合成制作提供了新的途徑和思路。皮膚組織工程支架材料主要采用靜電紡絲技術構建，其與傳統(tǒng)支架比較的優(yōu)點包括[1，2]:①特殊的三維多孔結構，各孔之間相互貫通，對支架上生長細胞的營養(yǎng)和代謝需求具有優(yōu)勢:②具有超過其他形式材料的體表面積，為細胞的粘附和功能性蛋白的附著提供了良好的條件;③皮膚表皮層的厚度為0.2～0.25mm，真皮層厚度約為0.4～0.45m

3、m，而靜電紡絲材料的厚度可在0.05～2mm之間，這使得靜電紡的材料在幾何尺寸上與細胞外基質的微觀結構存在一致性，因此靜電紡納米材料可以模擬皮膚細胞外基質的結構，達到更好模擬皮膚的作用。
　　本實驗通過從SD大鼠分離培養(yǎng)脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，將之與靜電紡的聚乳酸-聚己內酯/泊洛沙姆納米支架(PLCL/P123)共培養(yǎng)，構建組織工程皮膚，用以研究其是否加速大鼠創(chuàng)面愈合，并且擬

4、進一步探討靜電紡納米支架材料其促脂肪干細胞分化、增殖等相關分子機制。
　　材料與方法：
　?。ㄒ唬┲靖杉毎蛛x、鑒定、培養(yǎng)和誘導分化
　　1)自SD大鼠（6W齡，體重180g左右）的大鼠腹股溝切取脂肪組織，經常規(guī)酶消化法提取脂肪干細胞，觀察細胞形態(tài)、繪制生長曲線。
　　2)采用單克隆抗體標記ADSCs，然后采用流式細胞儀測定干細胞表面標志物:CD29、CD34、CD44、CD54、CD90等。
　　3)通

5、過誘導分化劑的誘導，將ADSCs誘導分化成脂、成骨和成表皮，通過油紅“O”染色、茜素紅染色和Von kussa染色、CK10免疫熒光染色了解干細胞成脂、成骨和成表皮情況。
　?。ǘ┚廴樗?聚己內酯/泊洛沙姆(PLCL/P123)靜電紡納米支架的制備及其特性鑒定
　　1)通過日本產靜電紡機器，制備四種不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架(75∶25、85∶15、90∶10、95∶5)。
　　2)采用掃描電鏡觀察不

6、同配比的混紡的PLCL/P123靜電紡納米支架的纖維形態(tài)和直徑大小。
　　3)采用SANS拉伸儀測定不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架的力學特性。
　　4)在光學顯微鏡下測定PLCL以及不同配比的PLCL/P123靜電紡納米支架的水接觸角。
　?。ㄈ┲靖杉毎cPLCL/P123靜電紡納米材料體外培養(yǎng)和生物學活性的研究
　　1)本組實驗共分6組:包括普通細胞培養(yǎng)皿平板組（對照組）、單純PLCL組、75∶

7、25、85∶15、90∶10、95∶5配比的PLCL/P123靜電紡納米材料組。
　　2)將細胞濃度為5×104/ml的ADSCs與以上6組材料在體外共同培養(yǎng)，電鏡下觀察ADSCs的生長情況。
　　3)將細胞濃度為2×105/ml的ASDCs與6組材料體外共培養(yǎng)，將共培養(yǎng)后的第1、3、7、10d的培養(yǎng)液收集，用RT-PCR法檢測其Ki67的表達量。
　　4)將ADSCs在PLCL/P123納米支架共同培養(yǎng)2d后，換表皮

8、誘導劑共同培養(yǎng)，誘導15d后用CK10免疫熒光染色，激光共聚焦電鏡下觀察成表皮情況。
　?。ㄋ模┲靖杉毎cPLCL/P123靜電紡納米材料構建組織工程皮膚對大鼠皮膚創(chuàng)面修復的研究
　　1)本組共采用SD大鼠8W齡，體重250g左右，12只分三組，包括A組:實驗組覆蓋創(chuàng)面采用ADSCs與PLCL/P123構建的組織工程皮膚組;B組:實驗組覆蓋創(chuàng)面采用無細胞的PLCL/P123納米支架組;C組:對照組，創(chuàng)面覆蓋采用凡士林紗布組

9、。
　　2)在8W齡的SD大鼠背部各切除兩個直徑為1.5cm大小的全層皮膚缺損創(chuàng)面，分左右兩側，間隔2cm。然后以A組-B組;A組-C組;B組-C組在大鼠背部兩側作對照，肉眼觀察大鼠背部創(chuàng)面愈合的情況并作比較。
　　3)切除21d的大鼠背部創(chuàng)面組織，直徑1.5cm，分別作HE染色、CK10免疫組化和免疫熒光染色，CD31免疫組化染色，組織學了解大鼠背部創(chuàng)面愈合的情況。
　　結果：
　　1.自SD大鼠腹股溝切取脂肪

10、，經常規(guī)酶消化法分離培養(yǎng)的細胞，具有干細胞的形態(tài)和特性，經流式細胞儀檢測其表面標志物的表達為CD29，CD44，CD54，CD90呈陽性表達，陽性率分別為95％，97％，88％，94％，而CD34表達呈陰性表達(0％);經定向誘導分化，發(fā)現(xiàn)ADSCs具有成脂、成骨、成表皮多向分化的潛能。
　　2.通過掃描電鏡顯示，經靜電紡技術制備的PLCL/P123納米支架材料具有較好的纖維直徑，其拉伸模量、拉伸強度與正常皮膚接近;PLCL材料的

11、接觸角為131.5±8.9°，75∶25、85∶15、90∶10三組的水接觸角為0°，而95∶5組水接觸角為7.8±2.7°，表明純PLCL的親水性差，而加入P123共混共紡后，可以顯著提高材料的親水性能，有利于水對材料的浸潤。PH值測定提示支架材料均為酸性，但85∶15、90∶10、95∶5相對酸性較弱。
　　3.ADSCs在普通細胞培養(yǎng)皿平板組（對照組）、單純PLCL組、四種75∶25、85∶15、90∶10、95∶5配比的P

12、LCL/P123靜電紡納米材料上共培養(yǎng)，激光共聚焦電鏡和Ki67檢測均發(fā)現(xiàn)ADSCs在PLCL/P123靜電紡納米材料上增殖生長明顯優(yōu)于對照組和純PLCL組，差別具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　4.采用A組（ADSCs與PLCL/P123構建的組織工程皮膚組）比無B組和C組創(chuàng)面愈合快;B組（無細胞PLCL/P123納米支架組）比對照組愈合快。創(chuàng)面愈合率三組差別具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　5.HE染色提示A組的創(chuàng)面

13、組織接近正常皮膚，CK10染色發(fā)現(xiàn)陽性，B組的 HE染色表皮結構不完整，CK10染色發(fā)現(xiàn)少量陽性表達，C組未見表皮結構，CK10陰性表達。經免疫熒光染色檢測，A組創(chuàng)面愈合的皮膚可見到經標記的ASDCs成為表皮樣細胞，皮下可見到大量新生的微小血管，其微小血管密度明顯大于B組和C組，差別具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　結論：
　　1.脂肪干細胞(ADSCs)分離培養(yǎng)簡單，容易獲取，其干性強，傳代穩(wěn)定，具有多向分化的潛能。