脂肪源性干細胞對凍傷創(chuàng)面愈合作用的研究.pdf

1、目的:提取脂肪源性干細胞(ASCs)并培養(yǎng);觀察干細胞形態(tài)及生長傳代情況;建立SD大鼠局部凍傷模型;探索脂肪源性干細胞對局部凍傷的治療作用，為凍傷治療探索新思路。
　　 方法:切取雙側(cè)腹股溝皮下脂肪組織。用酶消化法提取ASCs，L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，1×105個/ml接種于培養(yǎng)皿。利用倒置顯微鏡對原代細胞進行形態(tài)學(xué)觀察，培養(yǎng)干細胞至第三代，并應(yīng)用流式細胞儀鑒定。不同終濃度的5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）標(biāo)記ASCs，并行

2、細胞免疫熒光染色，于熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記情況;建立SD大鼠凍傷模型:于動物背部設(shè)計直徑22mm的圓形創(chuàng)面，通過手動制壓泵將液氮勻速泵出噴射于實驗區(qū)，致傷時間分別為0s、3s、5s、8s。致凍次日應(yīng)用激光多普勒血流探測儀測定血流灌注量并行統(tǒng)計學(xué)分析。處死動物后行皮膚組織HE染色。于致凍后3d，1w，2w對8只SD大鼠32個創(chuàng)面進行大體觀察。采用含5-Brdu標(biāo)記的第三代干細胞（濃度1×106/ml）1ml應(yīng)用于凍傷SD大鼠，A組空白對照組

3、，B組經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)5-Brdu標(biāo)記的ASCs懸液1ml，C組經(jīng)尾靜脈注射0.9％氯化鈉注射液1ml，D組局部注射5-Brdu標(biāo)記的ASCs懸液，E組局部注射0.9％氯化鈉注射液1ml，分別于移植術(shù)后7d，14d處死大鼠，切取凍傷創(chuàng)面進行組織固定，石蠟包埋，切片，HE染色及免疫熒光染色。觀察移植細胞參與創(chuàng)面愈合的情況。
　　 結(jié)果:細胞呈成纖維細胞樣生長，原代培養(yǎng)的細胞7～10d即達80％以上融合?？蛇M行常規(guī)傳代培養(yǎng)。流式細胞儀

4、鑒定第三代細胞表達:CD29、CD44表達陽性，CD31、CD45表達呈陰性。應(yīng)用手動液氮制壓泵致凍時間8s可造成SD大鼠背部皮膚重度凍傷創(chuàng)面。10mmol/L5-BrdU體外標(biāo)記第三代ASCs，孵育48h后標(biāo)記率達80％左右。5-Brdu體內(nèi)示蹤實驗組:細胞移植14d后大鼠創(chuàng)面局部及邊緣可見5-BrdU標(biāo)記的陽性細胞聚集;對照組中未發(fā)現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象;抗5-BrdU/FVIII、抗5-BrdU/波形蛋白免疫雙標(biāo)技術(shù)檢測結(jié)果顯示:在創(chuàng)傷