皮膚源祖細(xì)胞對(duì)去神經(jīng)皮膚創(chuàng)面愈合作用的研究.pdf

1、截癱病人引起的褥瘡和糖尿病外周神經(jīng)病變所致糖尿病足是臨床上最常見(jiàn)的慢性創(chuàng)面。近年來(lái)，機(jī)體組織創(chuàng)傷伴所支配神經(jīng)受損的慢性創(chuàng)面發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，而對(duì)于慢性創(chuàng)面的愈合機(jī)制和治療一直是醫(yī)學(xué)界有待解決的問(wèn)題。目前關(guān)于創(chuàng)面愈合機(jī)制的研究很多，但是關(guān)于去神經(jīng)支配的慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制鮮有報(bào)道。有研究表明，在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，皮膚神經(jīng)的再生是重要的環(huán)節(jié)，但神經(jīng)損傷是否對(duì)創(chuàng)面愈合有影響卻莫衷一是。 皮膚源祖細(xì)胞 (skin-derived precu

2、rsors，SKPS) 是一類分布于表皮基底層和毛囊隆突部的干細(xì)胞，具有神經(jīng)元干細(xì)胞的特性。國(guó)外有學(xué)者根據(jù)SKPs能夠在體外分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特性，將其應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明SKPs可重塑損傷的神經(jīng)髓鞘。這為SKPs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療方面帶來(lái)了廣闊的前景。 在此基礎(chǔ)上，本次課題通過(guò)將培養(yǎng)的皮膚源祖細(xì)胞應(yīng)用于去神經(jīng)創(chuàng)面治療，以觀察皮膚源祖細(xì)胞對(duì)去神經(jīng)創(chuàng)面細(xì)胞增殖活性、血管和神經(jīng)再生的情況。

3、 第一部分皮膚源祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的探討皮膚源祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及定向誘導(dǎo)成神經(jīng)元的方法，為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理想的種子細(xì)胞。方法取出生1～3d的昆明鼠皮膚，分離培養(yǎng)出皮膚源祖細(xì)胞；皮膚源祖細(xì)胞以含bFGF和10％FBS的培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)24h，再以含DMSO和BHA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)7d；觀察誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光鑒定細(xì)胞表達(dá)NF、NSE和GFAP情況；ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞分泌NGF和BDNF情

4、況。結(jié)果細(xì)胞誘導(dǎo)后呈多極性生長(zhǎng)；細(xì)胞免疫熒光表達(dá)NF和NSE，GFAP表達(dá)陰性；隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)培養(yǎng)液中BDNF和NGF濃度增加。結(jié)論皮膚源祖細(xì)胞在特定條件下能定向分化為神經(jīng)元，并且能提高神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，能為組織工程皮膚和修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)病變提供種子細(xì)胞。 第二部分去神經(jīng)支配對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響目的通過(guò)制備去神經(jīng)支配大鼠創(chuàng)面模型，觀察去神經(jīng)大鼠創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面血管和皮膚增殖改變情況，為去神經(jīng)創(chuàng)面愈合機(jī)制提供理論

5、依據(jù)。方法分離并切斷SD大鼠胸9～腰1右側(cè)脊神經(jīng)，造模后在背部對(duì)稱制作兩個(gè)直徑為1.0cm的圓形創(chuàng)面，分別觀察兩側(cè)創(chuàng)面愈合時(shí)間、創(chuàng)面大體和組織形態(tài)學(xué)、創(chuàng)面細(xì)胞增殖活性、創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中血管再生情況，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組愈合時(shí)間在4w，對(duì)照組為 3w；實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面上皮化速度慢于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組愈合表皮層較薄，上皮細(xì)胞大小不一；愈合時(shí)真皮和表皮層細(xì)胞增殖活躍，2～4w時(shí)實(shí)驗(yàn)組增殖活性低于對(duì)照組 (p<0.05)；創(chuàng)面微血管主要分布于真

6、皮層，密度隨愈合時(shí)間增加，但2～4w實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)較實(shí)驗(yàn)組弱 (p<0.05)。結(jié)論去神經(jīng)后皮膚創(chuàng)面細(xì)胞增殖低下，愈合時(shí)間延長(zhǎng)，血管再生現(xiàn)象受到抑制。 第三部分皮膚源祖細(xì)胞對(duì)去神經(jīng)皮膚創(chuàng)面愈合的作用目的通過(guò)將皮膚源祖細(xì)胞應(yīng)用于裸鼠失神經(jīng)支配創(chuàng)面，探索組織修復(fù)創(chuàng)面愈合的機(jī)制，同時(shí)為去神經(jīng)創(chuàng)面的治療提供新的實(shí)踐依據(jù)和思路。方法 30 只裸鼠制作雙側(cè)去神經(jīng)模型后，在失神經(jīng)區(qū)域制作直徑大小為0.5cm的圓形創(chuàng)面，第 3 代昆明鼠皮膚源祖細(xì)胞

7、四點(diǎn)注射至創(chuàng)面，治療后1w、2w和3w留取創(chuàng)面組織標(biāo)本，對(duì)創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面細(xì)胞增殖活性、血管和神經(jīng)再生進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組上皮化速度明顯較對(duì)照組加快，表皮層細(xì)胞較厚，2w時(shí)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面完全愈合，對(duì)照組愈合時(shí)間為3w，愈合后創(chuàng)面收縮較實(shí)驗(yàn)組明顯；愈合過(guò)程中創(chuàng)面細(xì)胞增殖活躍，3w時(shí)增殖現(xiàn)象減弱，各時(shí)間點(diǎn)增殖活性實(shí)驗(yàn)組明顯強(qiáng)于對(duì)照組； 神經(jīng)再生主要位于真皮層小血管附近，可見(jiàn)串珠狀或波紋狀彎曲的細(xì)小神經(jīng)分支，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)高于對(duì)照組；新生血管